3月龄α突触核蛋白A53T转基因小鼠认知功能的改变

徐玉钰 马泽刚

[摘要]目的探讨α突触核蛋白A53T转基因小鼠早期认知功能的改变及其可能的机制。

方法选取3月龄α突触核蛋白A53T转基因小鼠和野生型小鼠，采用新物体识别和转棒仪实验观察小鼠的认知及运动功能，采用Western Blot方法观察小鼠海马和前额叶皮质内脑源性神经营养因子（BDNF）表达，采用免疫组织化学的方法观察小鼠黑质多巴胺能神经元数目。

结果新物体识别实验表明，与野生型小鼠相比，A53T转基因小鼠出现认知功能障碍。Western Blot检测显示，A53T转基因小鼠的海马和前额叶皮质内BDNF的表达较野生型小鼠下调（t=2.584、4.189，P<0.05）。A53T转基因小鼠在旋转棒上的停留时间与野生型小鼠相比差异无显著性（P>0.05），黑质多巴胺能神经元的数目与野生型小鼠相比也无明显改变（P>0.05）。

结论3月龄A53T转基因小鼠出现认知功能障碍且早于运动症状的发生。

[关键词]A53T小鼠;认知功能障碍;帕金森病;脑源性神经营养因子

[中图分类号]R741

[文献标志码]A

[文章编号] 20965532（2018）02020204

帕金森病（PD）是一种常见的神经退变性疾病，其病理表现主要是黑质致密部多巴胺（DA）能神经元的选择性死亡和脑内路易小体的形成[13]。α突触核蛋白是PD特征性病理标志物路易小体的主要成分，在黑质DA能神经元中广泛存在[45]。在某些因素作用下，α突触核蛋白可发生构象变化形成聚集体，并引起DA能神经元的死亡[4，6]。PD经典的运动症状包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳等[7]。然而，一些非运动症状如嗅觉障碍、认知

[LL]能力下降、记忆力减退等可在运动症状出现之前发生或伴随着运动症状而发生[812]。目前，PD的研究多集中在黑质纹状体系统上。但有研究表明，只有当黑质区DA能神经元损伤或缺失达到80%以上时，才能出现明显的运动症状[13]。因此，对PD早期非运动症状进行研究并在发病前及时干预，将有利于延缓或阻止PD的发病进程。α突触核蛋白A53T转基因小鼠携带了人突变型α突触核蛋白A53T基因，且其运动症状出现较晚，可模拟PD发病过程中神经病理学过程的改变，是研究PD早期非运动症状的理想实验模型。本研究以该模型鼠为实验对象，探讨PD早期认知功能的改变以及可能的机制。现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1实验材料和动物

实验所用试剂除做特别说明外，均购自美国Sigma公司。脑源性神经营养因子（BDNF）抗体为美国abcam公司产品，βactin抗体为中国博奥森公司产品。选取20只雄性健康3月龄C57/BL6小鼠（其中A53T转基因小鼠和野生型小鼠各10只），体质量（22±2）g，由安徽博源实验动物有限公司提供。小鼠饲养温度为（19±2）℃，12 h/12 h昼夜自動循环光照，自由进食、饮水。

1.2实验方法

1.2.1转棒实验转棒实验可以评估小鼠的运动协调能力。小鼠首先被放置在静置的转棒上适应2 min，然后旋转杆以4～40 r/min均匀加速共5 min。实验期间，小鼠掉下转棒或在转棒上连续跑超过5 min，系统会自动停止，并记录小鼠停留在旋转杆上的时间。实验每天测试3次，连续3 d，取平均值。每次测试时间间隔不小于1 h。

1.2.2新物体识别该实验周期为5 d。前3 d是适应期：每只小鼠放置在测试箱内熟悉环境，测试箱内不放置任何物品，10 min后把小鼠放回原饲养笼内。第4天为熟悉期：将小鼠放回装有两个完全相同物体的测试箱中，让小鼠自由探索，训练持续10 min。第5天为测试期：先让小鼠在测试箱内自由探索两个相同的物体10 min，1 h后进行记忆测试。测试期和熟悉期过程类似，只是测试箱内的两个相同的物体中的一个被改变，测试5 min。每次测试结束后，用体积分数0.75乙醇清洗物体和箱子，以减少物体上的气味。如果小鼠在1 cm之内指向或用鼻子触及物体，则视为探索行为。用摄像机记录测试视频，离线分析并记录小鼠对新旧物体的探索时间。

1.2.3酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元免疫荧光化学染色行为学实验结束后，每组取5只小鼠用80 g/L水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉，先用37 ℃生理盐水灌注心脏15 min，待流出的液体变清澈后，快速换成40 g/L多聚甲醛灌注10 min，然后在冰上快速断头取脑。用40 g/L多聚甲醛在4 ℃下固定6 h，300 g/L蔗糖脱水24～48 h后，用包埋液将整个脑组织包埋后，进行连续冠状切片，切片厚度为20 μm。将收集的脑片放置在24孔板中，进行黑质区TH阳性神经元荧光染色及计数。1×PBS冲洗3次后，将脑片放置在配置好的兔抗小鼠TH一抗（1∶2 000）中，每孔300 μL，4 ℃摇床过夜。1×PBS冲洗3次后，每孔加入300 μL的山羊抗兔荧光二抗（1∶500），室温避光孵育2 h。1×PBS冲洗3次后，将脑片贴于载玻片上并用体积分数0.70甘油封片。使用蔡司显微镜进行扫描，计数黑质区TH阳性神经元总数。

1.2.4Western Blot方法检测海马和前额叶皮质BDNF蛋白的表达行为学实验后，每组取5只小鼠，冰上快速断头取脑，分离出左右两侧海马和前额叶，分别称质量后保存于-80 ℃备用。每4 mg组织中加入100 μL混合裂解液（RIPA与PMSF以体积分数99∶1混合而成），研磨成匀浆，于冰上静置裂解30 min。4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，吸出上清，应用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经过SDSPAGE电泳并湿转至0.22 μm的PVDF膜上。切出带有目的蛋白的条带，用50 g/L脱脂奶粉在室温下封闭2 h，分别用BDNF（1∶500）、βactin（1∶10 000）一抗于4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜后，分别用羊抗鼠HRPIgG（1∶10 000）和羊抗兔HRPIgG（1∶10 000）二抗室温孵育1 h。用ECL发光液进行显影，用LSUVP Vision WorksTM LS软件扫描后进行统计分析。

1.3统计学分析

采用Graphpad prism 5软件进行统计分析，计量资料数据以[AKx-D]±s表示，两独立样本均数比较采用 Students t检验。P<0.05表示差异有显著性。

2结果

2.1A53T转基因与野生型小鼠认知功能比较

实验结果表明，A53T转基因小鼠对新物体的探索时间为（52.70±4.96）s，对旧物体的探索时间为（45.24±2.51）s，A53T转基因小鼠对新旧物体的探索时间比较差异无显著性（P>0.05）;野生型小鼠对新物体的探索时间为（62.23±4.32）s，对旧物体的探索时间为（44.87±1.79）s，野生型小鼠对新物体的探索时间明显长于对旧物体的探索时间（t=3.283，P<0.01）。两组小鼠对新旧两种物体的总探索时间差异无显著性（P>0.05）。

2.2A53T转基因与野生型小鼠海马和前额叶皮质BDNF蛋白水平比较

A53T转基因小鼠与野生型小鼠海马的BDNF

水平分别为0.691 8±0.063 4和1.025 0±0.112 1，两组比较差异有显著意义（t=2.584，P<0.05）。A53T转基因小鼠与野生型小鼠脑前额叶皮质的BDNF水平分别为0.300 8±0.033 4和0.466 6±0.023 7，两组相比较差异有统计学意义（t=4.189，P<0.01）。

2.3A53T转基因小鼠和野生型小鼠运动协调能力比较

野生型小鼠停留在旋转杆的时间为（267.1±7.4）s，A53T转基因小鼠为（274.8±10.0）s，两组比较差异无显著性（P>0.05）。

2.4A53T转基因小鼠和野生型小鼠黑质区TH阳性神经元数目比较

野生型小鼠的黑质区TH阳性神经元为（6 945±

261）个，A53T转基因小鼠为（6 194±316）个，两组比较差异无显著性（P>0.05）。

3讨论

DA作为重要的神经递质，可控制情绪和运动能力[14]。本文研究结果显示，3月龄A53T转基因小鼠运动协调能力并无改变，且其黑质区DA标志物TH阳性神经元数目也没有明显改变，提示3月龄A53T转基因小鼠黑质区无明显损伤。推测调节运动功能的纹状体DA含量可能也没有明显变化，这可能是A53T转基因小鼠运动协调能力无明显障碍的原因之一。

本文研究结果显示，A53T转基因小鼠早期出现认知功能下降，海马和前额叶皮质的BDNF水平出现了下调。众所周知，海马和额叶皮质与学习记忆有着内在的联系，但目前尚不清楚这两个区域的损伤是否与认知功能障碍有关。但研究表明，海马损伤可能导致动物和人的空间记忆障碍[15]。另外，BDNF被认为是神经元存活的主要调节因子[1618]，BDNF基因的变化也与神经退行性疾病的發病有关[1921]。

[HJ2mm]

BDNF是维持神经元完整性和促进神经细胞生长与分化的重要调节因子，其主要表达于中枢神经系统的神经元内[2223]。另外，BDNF还有修复受损神经元，调节神经突触功能以及参与学习记忆的功能[24]。BDNF不仅在神经胶质细胞和DA能神经元中广泛分布，并且也分布在中枢神经系统的其他神经元中[2526]。本文研究结果显示，海马和前额叶的BDNF水平均下调，这可能是A53T转基因小鼠认知能力下降的一个原因。有研究结果表明，

在黑质区中正常浓度的α突触核蛋白可以同步提

[LL]高BDNF的水平，但在黑质中过度表达的α突触核蛋白却能下调BDNF的水平，这表明BDNF水平的下降也可能与突变型A53T小鼠α突触核蛋白的聚集有关[11，2728]。还有研究显示，老年鼠和AD病人海马中BDNF表达均出现了下调[2930]。另外，有研究在其他脑区内也发现了BDNF水平的改变，MOGI等[31]应用ELISA技术研究显示，PD病人黑质纹状体DA能神经元分布区的BDNF水平明显低于正常对照组，BDNF浓度的改变可能与PD的发病有着某种关联。另有研究发现，杏仁核是识别和调节情绪的脑区，也与学习和记忆相关，杏仁核内BDNF的下调也与抑郁症等相关[32]。但本研究中并未涉及其他脑区内BDNF水平的变化，有待今后进一步研究。

综上所述，在PD早期会出现认知功能障碍等非运动症状，且非运动症状会早于运动症状发生。在PD早期非运动症状中，认知功能障碍是最容易被发现的，但目前并不清楚出现认知功能障碍的确切原因。认知能力的下降可能是早期PD海马功能受损和脑相关区域BDNF水平下降所致。如能在运动症状出现之前及时诊断PD并进行干预，可减轻PD病人的痛苦。本文结果也为治疗PD病人认知功能障碍提供了一个有效的靶点。

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（本文编辑黄建乡）