气不摄血证免疫性血小板减少症患者细胞免疫功能变化及其临床意义

王明镜 胡晓梅 丁晓庆 许勇钢 全日城 谌海燕 邓中阳 赵攀 范腾 朱世荣

摘要 目的：觀察气不摄血证免疫性血小板减少症（ITP）患者细胞免疫功能变化，从细胞层面探究气不摄血证ITP的生物学基础。方法：选取2016年12月至2017年5月在中国中医科学院西苑医院与北京中医药大学东方医院门诊就诊的ITP确诊患者42例，依据中医证候积分分级标准，将患者分为轻度、中度、重度3组，同时纳入26例体检健康者作为对照组，观察各组Th1、Th2、Th17、Treg、Breg细胞的表达比例变化情况，并对上述免疫细胞的表达与中医证候积分的相关性进行分析。结果：与正常对照组比较，气不摄血证ITP患者Breg与Th17细胞的表达比例下降，Th1细胞的表达比例上升（P<0.05），Th1/Th2呈Th1型（P<0.05），Treg与Th2细胞的表达以及Th17/Treg比值无统计学意义。与对照组比较，轻度组（P<0.05）、中度组（P<0.05）、重度组（P<0.05）的Breg细胞的表达显著降低，Th1细胞的表达和Th1/Th2比值显著升高，Treg、Th2以及Th17细胞的表达、Th17/Treg比值差异无统计学意义。中度组与重度组Breg细胞的表达显著低于轻度组（P<0.05），其他免疫细胞的表达与轻度组比较差异无统计学意义。重度组上述免疫细胞细胞的表达与中度组比较差异无统计学意义。Bre细胞的表达与中医证候积分具有负相关性（r=-0.488，P=0.001），其余免疫细胞无相关性。结论：气不摄血证ITP患者细胞免疫功能变化表现为Th1细胞表达增加导致Th1/Th2失衡。Th17与Breg细胞表达水平下降。Breg细胞表达水平可能反映了气不摄血证患者的气虚严重程度。

关键词 气不摄血证；免疫性血小板减少症；免疫失衡

Abstract Objective：To analyze the immune function changes in patients with immune thrombocytopenia （ITP） with syndrome of qi failing to control blood，then figure out the material basis of the syndrome of qi failing to control blood based on the expressions of immune cells.Methods：According to the traditional Chinese medicine （TCM） syndrome score，42 patients with ITP in our hospital from December 2016 to May 2017 were separated into mild group （MIG），moderate group （MOG），and severe group （SG）.Twenty-six healthy people were as control group （CG）.The expressions of Th1，Th2，Th17，Treg and Breg and the relationship between the expressions of them and the TCM syndrome scores were analyzed.Results：As comparison with CG，the expressions of Breg and Th17 were lower （P<0.05），while the Th1，Th1/Th2 were higher （P<0.05） in the ITP patients.The expressions of Th2，Treg and Th17/Treg in ITP patients had no significant differences with those in CG.The expressions of Breg were lower，while as the expressions of Th1 and Th1/Th2 were higher in MIG （P<0.05），MOG （P<0.05），and SG （P<0.05） than those in CG.The expressions of Th2，Treg and Th17/Treg in the three groups had no significant differences with those in CG.As compared with MIG，all of the expressions of immune cells had no significant differences in MOG and SG，except the Breg.The expression of Breg in MOG （P<0.05） and SG （P<0.05） was lower than those in MIG.All the expressions of immune cells had no significant differences between in MOG and in SG.There were negative correlations between expression level of Breg and TCM syndrome scores （r=-0.488，F=0.001）.The other expressions of immune cells had no correlations with TCM syndrome scores.Conclusion：The higher level of Th1 expression leading to the imbalance of Th1/Th2 and the decreasing expressions of Th17 and Breg might be the signatures of ITP with TCM syndrome of qi failing to control blood.The level of Breg expression might indicate the level of Qi deficiency.

Key Words Syndrome of qi failing to control blood； Immune thrombocytopenia； Immune imbalance

中图分类号：R255.7文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.009

免疫性血小板減少症（Immune Thrombocytopenia，ITP）是一种以血小板减少为主要表现的常见的免疫相关疾病，临床表现血小板计数不同程度的减少、伴或不伴皮肤黏膜、脏器出血症状，属于中医“血证”“紫癜病”范畴。气不摄血证是ITP常见证型之一[1]。依据中医血证理论，气虚则无力摄血，进而血不循经，旁溢而出。长期以来现代医学对ITP的认识是从免疫角度出发，祖国传统医学的切入点则是从气血脉之间的相互联系，笔者认为找出2种思维方式之间的对应关系有助于从更深层次揭示ITP发病机制，也有助于挖掘人体在ITP疾病状态下气对血的作用进而有益于发现中医气不摄血证的发生、发展全过程，同时对探究中医气血理论的物质基础提供必要的参考资料。本研究遴选42例符合中医辨证气虚型血证ITP诊断的患者进行研究，并以26例体检健康者作为对照组，观察Th1、Th2、Th17、Treg、Breg细胞表达变化情况，并对上述免疫细胞与中医证候积分的相关性进行分析，拟从免疫细胞的层面入手，探讨气不摄血证ITP与免疫细胞变化与中医气不摄血证的关系，为研究中医气血理论的相关物质基础找到新的路径与方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年12月至2017年5月在中国中医科学院西苑医院与北京中医药大学东方医院门诊就诊的ITP确诊患者42例，男18例，女24例，年龄18～68岁，中位年龄49岁，对照组28例为我院体检健康志愿者，男14例，女14例，年龄21～55岁，中位年龄45岁。年龄和性别与观察组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究获得中国中医科学院西苑医院临床研究伦理委员会批准（2015XLA108-2）。

1.2 诊断标准 1）西医诊断：所有入选患者均参照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识（2012年版）》[2]。2）中医证候诊断：参照国家中医药管理局2010年出版的中医血液病重点专科紫癜病（免疫性血小板减少症）中医诊疗方案[3]。

1.3 纳入标准 符合免疫性血小板减少症诊断标准，病程≥3个月；符合气不摄血证；年龄在18～75岁之间。

1.4 排除标准 严重消化道和（或）脏器出血；脏器功能不全：血肌酐大于正常值上限；丙氨酸转氨酶、天冬氨酸酶、胆红素大于正常值的2倍；NYHA分级≥Ⅱ级；妊娠、哺乳期妇女、过敏体质者。

1.5 主要仪器 FITC标记的抗人CD4单克隆抗体、抗人CD38单克隆抗体、抗人IFN-γ单克隆抗体，PE标记的抗人CD25单克隆抗体、抗人CD24单克隆抗体，PC5标记的抗人CD19单克隆抗体、抗人CD4单克隆抗体、抗人IL-4单克隆抗体，APC标记的抗人CD127单克隆抗体、抗人IL-17A单克隆抗体，均为美国BD公司生产。流式细胞仪（EPICS ELITE型，BD公司）、Shel.LABCO2培养箱，美国SHELDON公司。RPMI1640培养液、红细胞裂解液OptiLyseC购自美国BD公司。

1.6 研究方法

1.6.1 外周血采集及处理 实验组与正常对照组，每个人取2 mL外周静脉血，其中1 mL用于检测Th1、Th2、Th17细胞群的样本采用肝素钠抗凝，另外1 mL用于检测Treg、Breg细胞群的样本采用EDTA抗凝。PBMC由密度梯度离心法分离，PBMC密度调整为1×109/L，加入20 μL CD4PC5避光静置30 min后加入1 mL胎牛血清的RPMI640培育液悬浮PMBC，37 ℃孵箱中18 h培养；具体操作按照试剂盒要求，配制完毕等待上机检测。

1.6.2 PBMC免疫细胞FCM检测 开机后Flow-Check校准光路，并自动设定实验的获取条件，包括PMT电压和荧光补偿，然后进入自动分析软件，以FSC/SSC设门，确定淋巴细胞群，获取1×104个细胞，应用EXPO 32软件分析。

1.6.3 气不摄血证程度分级 参照国家中医药管理局2010年出版的中医血液病重点专科紫癜病（免疫性血小板减少症）诊疗方案，气不摄血证主要临床症状与体征：皮肤紫癜、鼻衄、齿衄、月经量多、神疲乏力、气短、头晕目眩、面色不华、少食、便秘、便溏。量化评分：无（0分）、轻微（2分）、中等（4分）、显著（6分）。最后统计每一粒入组患者的评分结果。证候分级标准：1）轻度：总分≤22分；2）中度：总分：22～44分；重度≥44分。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件处理实验数据，实验结果以均数±标准差（±s）表示。分组之间的比较采用Kruskal-Wallis检验，相关性分析采用Spearman检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 气不摄血证ITP患者细胞免疫功能变化 气不摄血证ITP患者与健康对照组Th1、Th2、Th17、Treg、Breg细胞表达变化，以及Th1/Th2、Th17/Treg结果如表1所示。与正常人对照组比较，气不摄血证ITP患者Treg、Breg、Th17、Th2细胞比例下降，Th1细胞比例上升，Breg、Th17、Th1细胞、Th1/Th2差异有统计学意义（P<0.05），Treg、Th2细胞，Th1/Th2、Th17/Treg差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 不同程度气不摄血证ITP患者细胞免疫功能变化 轻度组、中度组、重度组ITP患者与健康对照组Th1、Th2、Th17、Treg、Breg细胞比例变化，以及Th1/Th2、Th17/Treg比值结果如表2所示。与对照组比较，轻度组、中度组、重度组的Breg细胞表达均显著降低（P<0.05），轻度组、中度组、重度组的Th1细胞表达、Th1/Th2比值均显著升高（P<0.05），Treg、Th2、Th17细胞表达、Th17/Treg比值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。中度组与重度组的Breg细胞表达显著低于轻度组，而中度组、重度组的其他免疫细胞与轻度组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。重度组的上述免疫细胞与中度组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 Breg细胞表达与气不摄血证程度的相关性 Breg细胞表达与气不摄血证积分的相关性分析如图1所示，r=-0.488，P=0.001，表明Breg细胞表达与气不摄血证程度呈负相关（P<0.05）。而Th1、Th2、Th17、Treg细胞表达与气不摄血证程度未显示相关性（P>0.05）。

3 讨论

ITP以皮肤、黏膜或内脏出血为主要的临床表现，属于中医学的“血证”“虚劳”等范畴，目前统称为“紫癜病”[3]。气不摄血证是中医“血证”的常见证型之一[1]，气虚不摄则血不归经，发生各种病证。历代医家关于气虚引发“血证”的论述颇为丰富：《医述·血证》：“气虚不统者，血必散漫”。《景岳全书·血证》：“损者多由于气，气伤则血无以存”。清代医家吴澄更是从“天地之道”将气虚与出血的关系进行概括：“天地之道，无形者依有形，有形者附无形，互相依附。天地之道，亦即气血之道也。气之高，未有不由于血之散，而血之脱未有不由于气之虚。所以善治者，不治其血，而专治其气。气旺则阳能统阴，而血自归经矣”。

现代医学认为ITP的发病与机体免疫调节功能失常导致血小板生成障碍或血小板破坏过度有关，其中T、B淋巴细胞亚群分泌异常而导致的免疫失衡是主要的发病机制之一，涉及到Th1、Th2、Th17、Treg、Breg数量异常，以及Th1/Th2、Th17/Treg失衡[4-7]。Th1细胞能有效介导细胞免疫，主要作用是增强吞噬细胞介导的抗感染免疫，特别是抗胞内病原体的感染；Th2细胞可以刺激体液免疫，参与变态反应、对抗细胞外多细胞寄生虫感染[8-9]。Th17细胞在防御胞内细菌感染的免疫应答、介导慢性炎性反应和自身免疫性疾病中发挥重要作用，参与了多种急慢性免疫性疾病的发病[10]。Treg细胞是一种具有免疫抑制功能的T细胞亚群，能维持免疫系统对自身成分的耐受，使机体保持免疫稳态。Breg是一群能在多种免疫性疾病中发挥负性调节的作用且与分泌免疫球蛋白无关联的B细胞亚群，可以促进Treg细胞的分化[11]，调节Th1/Th2平衡[12]，抑制原始T细胞分化为Th1、Th17细胞[13]。

本研究发现，气不摄血证ITP患者Th1细胞分泌显著高于对照组，Th2细胞分泌与对照组比无显著差异，Th1/Th2存在失衡现象且倾向于Th1型；Th17细胞分泌低于对照组，Treg分泌情况与对照组无显著差异，Th17/Treg与对照组比较无显著差异；Breg分泌显著低于对照组。既往认为，ITP患者Th1分泌水平升高，Th2细胞降低，Th17水平升高，Treg分泌降低，进而Th1/Th2失衡、Th17/Treg失衡，即炎性反应因子分泌过多而抑炎因子分泌不足导致ITP发病[14-16]。我们认为，气不摄血证ITP患者发病机制主要是由于Breg细胞分泌不足，对Th1细胞抑制不足，导致Th1分泌过量，同时Th17向Th1发生了转换，加剧Th1/Th2失衡，Th2细胞与Treg细胞未参与到气不摄血证的发病过程，与既往的研究结果不尽相同。Henriques研究发现Th17可以产生IL-2、TNF-α、IFN-γ等Th1型细胞因子，进而诱导T细胞向Th1型极化[16]，与我们的观点一致。另外，研究发现TGF-β对Th17细胞的分化起促进作用[17]，而IFN-γ可以通过抑制TGF-β相关信号，干扰TGF-β对Th17细胞分化的诱导作用，进而抑制Th17细胞的分化数量[18]，而IFN-γ主要由Th1细胞分泌，据此，我们认为，Th1细胞可以抑制Th17生成，高表达的Th1细胞会造成Th17分泌减少。Adams[19]等研究发现，ITP患者可以出现Th1细胞数量减少、Th17分泌数量增多的情形，与我们的研究相反，但其纳入的ITP患者中医证型未知，因此，我们认为ITP发病复杂多样，需要进一步细化入组标准，扩大样本量深入研究。

同时，本研究发现，Breg的分泌與中医证候积分具有显著负相关性，轻度组、中度组、重度组3组之间Breg的分泌呈现出递减趋势，当Breg分泌降低时，中医证候积分显著升高，意味着患者气不摄血相关中医症状加重。据此我们推断，Breg细胞异常影响到气对血的固摄功能，Breg的变化间接的反映了此型ITP患者的气虚严重程度。本研究结果表明，细胞免疫功能的变化，反映了气不摄血证ITP的发病机制与生物学基础，也为中医益气摄血法治疗气虚型ITP以及其他“血证”提供了生物学依据。

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