戊糖片球菌P36对HepG2细胞 抗氧化能力影响的初步研究

陈 佩,党 辉,郭红军,翟彩宁

(1.陕西广播电视大学,益生菌功能及应用协同创新中心,陕西西安 710062;2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710062)

正常状态下,人体中自由基的产生和清除处于动态平衡状态,但由于种种原因导致机体自由基产量升高或者机体清除自由基的能力下降时,机体就会出现氧化应激,这种状态会使机体受到一定的损伤,引发机体功能障碍,可导致肠道组织损伤[1],动脉粥样硬化[2]、肝病[3]、糖尿病和癌症[4]等疾病的发生。目前,可通过抗氧化剂来清除活性氧,但是人工合成的抗氧化剂大多数为芳胺类或苯酚类,均具有一定的毒性,长期使用会给机体带来一系列的副作用,例如对肝、脾和肺均有不利的影响[5-6]。因此寻求更为安全天然的抗氧化剂是非常必要的[7]。

乳酸菌是一类能够发酵碳水化合物产生主要终产物为乳酸的革兰氏阳性菌,在自然界分布广泛,具有调节人体肠道微生态[8]、调节免疫力[9]、降低血糖[10]和延缓衰老[11]等功能,是公认的安全级微生物[12],被广泛地应用于食品生产工业和发酵领域。近年来,乳酸菌在体内外的抗氧化能力得到了广泛的研究。刘宏宇等[13]对25株乳酸菌进行体外抗氧化研究发现不同来源乳酸菌的抗氧化活性存在种间和种内差异。Ji等[14]从奶牛粪便中分离出四种乳酸菌,经测定发现都具有很好的抗氧化活性,可用于开发抗氧化剂。余芳等[15]从传统发酵食品中分离得到10株乳酸菌,发现其都具有一定的抗氧化活性。

本研究以前期从陕南泡菜中筛选出的一株高产胞外多糖的戊糖片球菌P36为研究对象[16],拟通过H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤模型对乳酸菌抗氧化能力进行评价,研究该菌株对HepG2细胞抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

戊糖片球菌P36 分离自陕南地区农户自制泡菜;人肝癌细胞系HepG2细胞株 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 美国sigma公司;DMEM低糖培养基、双抗(青、链霉素)、0.25%胰酶(含0.02% EDTA)、胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA) 美国Gibico公司;MRS液体培养基 青岛海博生物技术有限公司;总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司。

LRH-150型恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;HEPA Class 100型CO2细胞培养箱 美国Thermo公司;SW-CJ-1CV超净台苏州安泰空气技术有限公司;5415R 冷冻离心机 德国Eppendorf公司;VCX500超声波破碎仪 美国Sonics公司;UV-2450紫外可见分光光度计 日本岛津公司;CX41-12C02倒置显微镜 日本Olympus公司;DM2000型荧光显微镜 德国Leica公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌菌种的培养 将冻存于-80 ℃的乳酸菌接入MRS液体培养基中,37 ℃培养18 h,连续活化三代后用于后续实验。

1.2.2 乳酸菌的菌液制备 将培养好的乳酸菌在4 ℃条件下,以6000 r/min离心10 min,弃上清液,菌体用磷酸盐缓冲液(pH7.2)离心洗涤3次,菌液浓度调节为1×109CFU/mL。

1.2.3 细胞培养 将HepG2细胞按常规方法复苏后,置于含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸(NEAA)、1% L-谷氨酰胺和1%双抗的低糖DMEM培养液中,37 ℃,5% CO2的培养箱中进行培养,隔天更换一次培养液,待细胞贴壁融合率达80%左右时,用含0.02% EDTA 的0.25%胰酶消化细胞,按1∶3传代。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.4 H2O2对HepG2细胞氧化损伤模型的建立 参照文献[17]的方法有所改动,将对数生长期中的HepG2细胞按照2×105个/mL接种到96孔板中,每孔100 μL,37 ℃,5% CO2的培养箱中培养24 h后,加入100 μL含H2O2终浓度为0.10 mmol/L的DMEM培养液,作用2 h,以此建立氧化损伤模型。

1.2.5 MTT法检测细胞存活率 参照文献[18]的方法有所改动,96孔板中每孔加入5 g/L 的MTT 40 μL,置入37 ℃、5% CO2培养箱中,孵育4 h,吸出培养液,每孔加入150 μL的DMSO溶解结晶,37 ℃培养箱中放置10 min,确保紫色结晶充分溶解,振荡混匀后,酶标仪测定各孔在570 nm处的吸光度值。按公式计算细胞存活率:

细胞存活率(%)=(实验组A570/对照组A570)×100

1.2.6 实验分组 参照文献[19]的方法有所改动,用0.25%的胰酶消化收集生长处于对数生长期的HepG2细胞,以2×105个/mL的细胞密度接种于6孔培养板,每孔2 mL培养液,置入37 ℃、5% CO2培养箱中,培养24 h后,分组处理:空白对照组,加入2 mL DMEM完全培养液;模型组,加入2 mL含H2O2的DMEM培养液;乳酸菌组,同时加入含H2O2的DMEM培养液和戊糖片球菌P36(1×109CFU/mL)2 mL,继续培养12和24 h。

1.2.7 样品收集 细胞继续培养12和24 h后吸取培养上清液装入离心管,-80 ℃冻存备用。每孔用PBS(pH7.2)洗涤3次,然后每孔加1 mL 1%的Triton X-100用吸管充分吹匀,2000 r/min 离心15 min,收集上清即为细胞裂解液,-80 ℃冻存备用。

1.2.8 指标测定 T-AOC、SOD、GSH、GSH-Px、CAT、POD、LDH和MDA指标测定方法均按照试剂盒说明书进行。

1.2.9 细胞形态观察 参照文献[20]的方法有所改动,将HepG2细胞以2×105个/mL的密度接种于6孔培养板,培养24 h使细胞爬片,后进行实验(造模及乳酸菌处理),实验结束后,PBS(pH7.2)洗涤3次,避光加入DAPI工作液(1 μg/mL)淹没平皿底部,染色20 min后,PBS(pH7.2)漂洗3次后封片,避光用荧光显微镜观察。

1.3 数据分析

数据统计采用SPSS 16.0进行one-way ANOVA,Tukey’s多重检验(p<0.05),数值以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 戊糖片球菌P36对HepG2细胞培养上清液抗氧化能力的影响

从表1可以看出,12 h时,与对照组相比,模型组细胞上清液中的GSH-Px的活力显著增加了74.24%(p<0.05),POD活力显著降低24.38%(p<0.05),SOD、GSH、CAT和MDA的含量无显著性差异(p>0.05),表明此时模型组细胞还未进入氧化应激状态。与模型组相比,添加戊糖片球菌P36 12 h后,细胞上清液中的T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活力都有显著提高,分别显著提高了58.78%、22.63%、27.59%和125.93%(p<0.05),POD的活力显著降低了44.10%(p<0.05),MDA含量增加了19.05%,此与崔志文等[21]研究结果一致,表明戊糖片球菌P36可以提高细胞抗氧化能力,但是对细胞也有一定的刺激作用。24 h后,与对照组相比,模型组细胞上清液中的T-AOC显著降低了43.41%(p<0.05),SOD、GSH-Px和CAT的活力分别显著降低11.43%、51.85%和46.86%(p<0.05),同时POD活力显著增加32.22%(p<0.05),MDA含量显著增加80.93%(p<0.05),表明此时细胞已表现为氧化应激状态。与模型组相比,添加戊糖片球菌P36 24 h后,细胞上清液中的T-AOC和SOD的活力显著增加了145.34%和122.54%(p<0.05),GSH-Px、CAT和POD的活力显著增加(p<0.05),GSH和MDA的含量分别显著降低了27.71%和49.43%(p<0.05)。王玉华等[22]研究表明鼠李糖乳杆菌具有高效清除羟自由基和超氧化阴离子自由基的能力,其抗氧化作用的活性成分可能与活细胞和细胞内活性成分有关。Kullisaar 等[23]研究表明益生菌发酵的山羊乳可以提高人体SOD和GSH-Px活力,降低肠道氧化应激,增强抗氧化能力。

表1 细胞上清液在12和24 h时的抗氧化活性Table 1 Antioxidative activities of cells supernatant at 12 and 24 h

综上所述,P36提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT和POD的合成和分泌效率,增强了细胞的抗氧化能力。

2.2 戊糖片球菌P36对HepG2细胞裂解液抗氧化活性的影响

由表2可知,12 h后,与对照组相比,模型组细胞裂解液中SOD活力含量有所降低,但差异不显著(p>0.05),GSH含量显著降低(p<0.05),POD的活力显著提高了92.34%(p<0.05)。结果表明此时细胞刚开始受到刺激,胞内POD活力增加以保护细胞免受损伤。添加戊糖片球菌P36 12 h后,乳酸菌组的细胞裂解液中SOD活力与对照组和模型组相比分别显著增加了14.32%和17.49%(p<0.05);POD的活力与对照组相比显著增加了101.62%(p<0.05),和模型组相比也有所增加;GSH的含量与模型组相比显著增加(p<0.05)。表明此时细胞受到乳酸菌的氧化刺激作用,胞内的氧化酶含量随之升高。24 h后,与对照组相比,模型组细胞裂解液中的SOD活力和GSH含量分别显著增加了43.79%和60.81%(p<0.05);POD活力也有所增加。

表2 细胞裂解液在12和24 h时的抗氧化活性Table 2 Antioxidative activities of cells lysate at 12 and 24 h

添加戊糖片球菌P36组的SOD活力比对照组有所增加,但比模型组显著降低了19.76%(p<0.05);POD活力比对照组和模型组分别显著增加了114.46%和93.63%(p<0.05);GSH含量比对照组显著增加了72.01%(p<0.05),与模型组相比也有所增加。

综上所述,此时模型组的细胞已受到强烈的氧化应激,细胞内的抗氧化物SOD开始大量合成,以保护细胞免受损伤。另外,戊糖片球菌P36通过刺激提高细胞内POD的活力,增强了细胞的抗氧化作用,对细胞有一定的保护作用。有研究表明植物乳杆菌可以提高Caco-2细胞的抗氧化酶活性,具有很强的抗氧化活性[24],本研究与此结果一致。

2.3 戊糖片球菌P36对HepG2细胞形态的影响

DAPI是一种荧光染料,它可以穿透完整的细胞膜,与细胞内的DNA强力结合,在荧光显微镜下观测呈现蓝色至青绿色。如图1所示,HepG2细胞经过不同处理后,再进行DAPI染色,在荧光显微镜下可以明显看出其细胞形态的变化情况。图1A显示正常HepG2细胞的核DNA与DAPI特异性结合后,细胞核的轮廓清晰可见,呈圆形或椭圆形,核内呈现均匀弥漫的荧光,细胞质无荧光。图1B所示,经过H2O2损伤后的HepG2细胞形态明显改变,细胞核皱缩,体积变小呈不规则形状,核内呈现致密浓染的块状凝聚强荧光。图1C所示,加入戊糖片球菌P36后,细胞受损程度明显低于图1B中模型组细胞,少数细胞发生凋亡,其细胞核皱缩,体积变小,但大部分细胞形态正常,呈现均匀弥漫的荧光。此结果与上文结果相符,即反映出戊糖片球菌P36具有抗氧化的能力,能够减少H2O2对HepG2细胞的损伤。

图1 荧光显微镜下HepG2细胞核形态(400×)Fig.1 Morphology of nucleus in HepG2 cells with fluorescence microscope(400×)注:A:正常组；B:模型组；C:乳酸菌组。

3 结论

本文对一株高产胞外多糖的戊糖片球菌P36对HepG2细胞的抗氧化能力进行了研究。将HepG2细胞分为空白对照组、模型组和乳酸菌组。细胞培养至12和24 h时分别测定其上清液和细胞裂解液的抗氧化活性。并利用DAPI对HepG2细胞进行染色后观测不同组细胞核形态的变化。结果表明,戊糖片球菌P36与经H2O2诱导的HepG2细胞共培养24 h后表现出一定的抗氧化作用。细胞上清液中的抗氧化酶活力均显著增加(p<0.05),GSH和MDA的含量均显著降低(p<0.05),细胞裂解液中的SOD活力显著降低(p<0.05)。因此,戊糖片球菌P36能够明显减轻H2O2对细胞的氧化损伤,使HepG2细胞受损程度降低。为了更深入探讨戊糖片球菌P36的抗氧化能力,后续将进一步开展相应的动物实验研究。