复方苦参注射液对肝癌细胞增殖及自噬的影响

阳卫立 刘 清 刘址忠 王 伟 罗永胜 胡双成

复方苦参注射液 （Compound kushen injection,CKI）是由苦参、白土苓两味中药精制而成。中医认为，苦参具有清热燥湿之功效。苦参含有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱等多种活性抗癌成分[1-2]，具有抑制肿瘤细胞生长，止痛，抗炎，增加机体免疫力等作用。Zhang等[3]研究者在实验中发现苦参碱可诱导大鼠C6胶质瘤细胞的自噬作用。自噬作为一种细胞死亡过程，与肿瘤的发生、发展密切相关，在抑制肿瘤细胞方面起着很大作用。肝癌作为中国发病率较高的肿瘤，也是中国恶性肿瘤病死的主要原因，近年来肝癌的发病率逐年升高，肝癌已经成为肿瘤领域研究的热点。本研究旨在探讨复方苦参注射液对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及自噬的影响，为进一步研究奠定基础。

材料与方法

一、材料

人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国医学科学院细胞资源平台。复方苦参注射液购于山西振东制药公司，LC3兔抗人单克隆抗体购于sigma公司，SOSTEM1兔抗人单克隆抗体购于CST公司。RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司。

二、MTT法测定细胞活力

将肝癌细胞SMMC-7721以1×104/cm2的密度接种到96孔培养板中，每孔接种100μL，每组5个平行孔。接种24 h后，加入不同浓度的复方苦参注射液继续培养48 h。采用MTT法测定细胞生长状况，每孔加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT。继续培养4 h后，弃去上清，每孔加150μL DMSO，30 min后用自动酶标仪于490 nm测定各孔吸光度。

三、RT-PCR法测定自噬相关基因的转录水平

按照Trizol试剂盒的说明书，从处理后不同时间收集的SMMC-7721细胞中提取RNA并检测其浓度。然后，用RNA逆转录成cDNA的试剂盒（Applied Biosystems，4387406）将 2 μg 总 RNA 反应得到cDNA。再将50 ng的cDNA用于qRTPCR。其中引物以300 nm的浓度加入到PCR反应中。PCR反应的所有其他组分来自SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒（TaKaRa，DRR820A）。用 ABI 7500系统（Applied Biosystems,USA）进行 PCR反应，然后进行熔解曲线分析。使用阈值循环（Ct）值通过比较Ct方法评估具有不同处理和暴露时间的样品中RNA表达的相对差异。通过使用3种不同的RNA样品的逆转录反应对实验进行3次重复，结果取平均值。

四、Western blot法测定自噬相关基因的蛋白水平

肝癌细胞SMMC-7721以1×105/cm2的密度接种到6孔培养板中，24 h后，加入不同浓度复方苦参注射液作用不同时间。按照RIPA蛋白裂解液的说明书，于冰上提取肝癌细胞SMMC-7721蛋白，经BCA法进行蛋白定量后上样，SDS-PAGE电泳对蛋白进行分离，PVDF膜，转膜条件为70 V，1 h，5%牛血清白蛋白封闭 1 h，加一抗 GAPDH（1:5 000）、LC3（1:3 000）、SQSTM1（1:10 000）4 ℃ 过夜，加二抗（羊抗兔 IgG 1:10 000）室温孵育 1 h，TBST洗膜，用Biorad凝胶成像系统成像。以目的蛋白与内参蛋白GAPDH吸光度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

五、统计方法

运用SPSS 20.0对实验数据进行统计学处理。计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析（oneway ANOVA），两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、复方苦参注射液对细胞增殖的影响

MTT实验结果显示，复方苦参注射液对肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制呈浓度依赖性。不同浓度的复方苦参注射液作用48 h后，0.5 mg/mL复方苦参注射液作用于SMMC-7721细胞的活力是对照组的92.0%，而1 mg/mL时是85.1%；2 mg/mL是对照组的59.3%，而4 mg/mL时仅为37.9%。方差分析结果显示，不同浓度组与对照组的差异均有统计学意义（P ＜ 0.05），见图 1。

图1 复方苦参注射液对SMMC-7721细胞活动的影响（*与0 mg/mL 比较，P＜0.05）

二、复方苦参注射液对自噬相关基因转录水平的影响

我们研究了复方苦参注射液对自噬相关基因MAP1LC3B及SQSTM1的转录水平的影响。根据MTT的结果，分别选取了1 mg/mL和2 mg/mL 2个剂量及6 h，12 h 2个时间点来提取RNA进行RTPCR。与正常对照组比，复方苦参注射液处理后的SMMC-7721细胞MAP1LC3B及SQSTM1的转录水平均有增高，且呈剂量和时间依赖。相对来说，MAP1LC3B增加的幅度更高，SQSTM1增加的幅度较小。方差分析结果显示，不同浓度不同时间的数据间差异均有统计学意义。见图2和图3。

三、复方苦参注射液对自噬相关蛋白表达的影响

我们研究了复方苦参注射液对自噬相关蛋白MAPILC3B及SQSTM1表达水平的影响。为了和RT-PCR实验一致，分别选取了1 mg/mL和2 mg/mL 2个剂量及6 h，12 h 2个时间点来提取蛋白进行Western blot。与正常对照组比，复方苦参注射液处理后的SMMC-7721细胞MAP1LC3B蛋白增高，无剂量和时间依赖。而SQSTM1蛋白呈剂量依赖的减少，和时间关系不明显。方差分析结果显示，不同浓度的数据间差异均有统计学意义。见图4。

图2 复方苦参注射液对MAP1LC3B基因转录的影响（*与 0 h比较，P＜0.05）

图3 复方苦参注射液对SQSTM1基因转录的影响（*与 0 h比较，P＜0.05）

图4 复方苦参注射液对LC3及SOSTM1蛋白表达的影响

讨 论

复方苦参注射液是由苦参和白茯苓经过提取分离而成的注射剂，其主要成分为苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、氧化槐定碱等[4]。既往研究显示的研究，苦参碱具有良好的抗人肝癌细胞增殖的作用[5-7]。本研究发现，复方苦参注射液也能显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖，与文献报道相符。但究竟是哪一种成分还是这些成分协同作用起到了抗肿瘤的作用，尚需进一步研究。

正常生理状态时，自噬在细胞中处于一个较低的基线水平，清除细胞内受损或无功能的长寿命蛋白质和细胞器，将其消化为小分子物质供细胞重新利用进而维持细胞的稳态。过度激活的自噬则参与细胞死亡的过程，也就是说当细胞出现自噬后，如果过多的细胞器或蛋白质进入自噬小泡而被降解，细胞的功能就会严重受损出现不可逆的改变，从而导致细胞死亡。LC3是参与自噬发生的关键基因，其表达产物包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，当自噬发生时，LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ，LC3含量与自噬活性密切相关，是自噬的标志分子[8]。本文结果显示，复方苦参注射液作用于人肝癌细胞SMMC-7721后，自噬相关基因LC3及SQSTM1转录明显增加，蛋白LC3b－Ⅱ表达明显上调，SQSTM1蛋白表达明显下调。SQSTM1的转录和蛋白表达水平是不一致的，但LC3才是金标准，SQSTM1是辅助标准，转录和表达不一致也是可能的。

综上所述，复方苦参注射液可通过抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖并能诱导细胞自噬。但复方苦参注射液抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖和细胞自噬之间有什么样的信号通路在起作用，值得进一步研究。

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