不同温度对淇河鲫胚胎发育的影响

吴利敏，袁淑仪，赵晨华，潘启根，樊素晗，田雪，王磊，李学军

(河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007)

淇河鲫(Carassiusauratus)，鲤形目(Cypriniformes)，鲤科(Cyprinidae)，鲫属(Carassius)，是鲫鱼在漫长的进化过程中形成的变异地方性种群之一，可以通过雌核发育这种单性生殖方式繁殖后代，在河南北部广泛养殖，也是河南省特有的名贵鱼类[1～4]。尽管淇河鲫具有很多优良的性状，但由于各种原因，淇河鲫的基础研究和养殖开发都发展缓慢，导致其养殖规模和推广地域都远远落后于彭泽鲫、异育银鲫和工程鲫等鲫鱼。自从淇河鲫被引种成为人工养殖对象，其养殖规模不断扩大，对淇河鲫苗种的需求量也增大，因此围绕淇河鲫胚胎发育特性及其影响因素展开研究就显得尤为必要。

探究淇河鲫胚胎发育特性，首先要对鱼类早期发育的总体研究现状有所了解。鱼类胚胎发育是一个涉及了多种因素参与的复杂而连续的生长过程，涵盖了外部形态发生、细胞分化和胚胎组织间相互影响等阶段，虽然起决定作用的是细胞内基因的表达等遗传因素，但是正常的胚胎发育过程还常常要受到温度、溶氧、pH值、盐度、光照强度等多种生态因子的制约[5，6]。其中，温度对鱼类的生长发育繁殖及新陈代谢等各种生理机能都有巨大的影响，其产卵、胚胎发育、仔鱼生长所需要的适宜温度也不尽相同，而在这些生理过程中，胚胎发育对适宜的温度最为依赖[6]。

多种研究表明不同的孵化温度不仅会影响胚胎的孵化历时，也会影响胚胎内部的形态、胚胎孵化率与受精率，更甚者会影响仔鱼的体长、卵黄囊大小及肌节的分化[7～10]。多数鲤科鱼类孵化历时3～4天不等，而影响其孵化历时的最重要因素就是温度；在非鲤科鱼类中，温度对胚胎及幼鱼发育影响的研究更是数不胜数，并且这些研究结果均表明，在一定限度内，随着温度的升高，胚胎发育进程加快，且温度对胚胎的孵化率与受精率均存在显著影响，但温度过高会影响胚胎成活率甚至会影响初孵仔鱼的生长及发育[11～21]。

根据郭永灿[8]的研究，鲢、草鱼胚胎只有在16～33 ℃才能成活，对温度较为敏感的发育阶段有原肠期、囊胚期和出膜期，而原肠期是鲢、草鱼胚胎对温度最敏感的阶段。观察不同温度下胡子鲶受精卵的发育情况，发现低温(20±1.5 ℃)条件中，在胚孔封闭前胚胎尚能保持正常发育，一旦到达器官分化时期则会出现尾芽无法伸长或背部隆起等畸形情况，并且在胚胎孵化前死亡[22]。陈昆慈等[23]认为，宝石鲈胚胎正常发育温度范围是21～31 ℃，最适温度在24～27 ℃，胚胎发育历时与温度成反比例关系。随着对鱼类胚胎温度敏感性研究的深入，南海水产研究所李加儿等[24]发现，温差对胚胎发育早期的影响较小，但是一旦进入原肠期，不同温度下的胚胎发育特性即呈现出明显差异。

在自然条件或人工饲养条件下，常常会发生温排水、天气变幻、活鱼运输以及生产养殖等引起的温度骤变，所以探究温度对淇河鲫胚胎发育影响具有很高的生产实际价值。异育银鲫胚胎正常发育温度范围是13～25 ℃，孵化历时随温度上升而缩短，最适温度范围内孵化率最高[18]。温度骤变对稀有鮈鲫胚胎不同发育阶段的影响不同，胚孔封闭期是热敏感期，眼基期耐受温度骤变的能力大于肌肉效应期[11]。

尽管生物机体对温度的变化具有一定的适应调控能力，但是这种调控能力有限，如果超出了适应能力范围，就会引起机体正常生命活动受到干扰，极端情况下甚至可能造成死亡。确定胚胎发育的合适温度是人工繁育所必须掌握的基础生物学指标。关于不同温度对淇河鲫胚胎发育的影响的研究目前鲜有报道，因此，本研究初步展开温度对淇河鲫胚胎发育影响的研究，也为探索雌核发育过程与普通两性结合有性生殖的区别提供了一定的参考，更为生产上淇河鲫苗种繁育以及资源增殖提供参考资料。

1　材料和方法

1.1　亲鱼来源

淇河鲫取自河南师范大学水产养殖基地，在淇河鲫繁育季节挑取体质健壮、性腺发育良好、个体大小均一的亲鱼(约500 g左右)。

1.2　人工催产及胚胎孵化

2017年4月20日将雌雄亲鱼按8∶1的比例放入亲鱼池，人工注射催产素，随后放入养殖系统进行流水刺激，效应时间结束后采用干法受精获得受精卵，将受精卵均匀撒在15个直径40 cm的玻璃培养皿中，受精卵会黏在培养皿底部，每个培养皿中胚胎数量相仿，控制在100粒左右。然后将培养皿分为5组，每组3个平行，各组水温分别控制在24，27，30，33 ℃；剩下一组作为对照保持在室温(21 ℃左右)孵化。每隔10 min调整一次加热棒，每次上调3 ℃，直到温度稳定在各实验组设置的温度。每天为各个温度条件下胚胎换水一次，每次换水前将水温调至实验设置温度再换水，确保不影响胚胎发育。

1.3　胚胎观察

参考马海艳等关于银鲫胚胎发育观察结果[18]，定期观察淇河鲫胚胎发育状况，发育时序以50%的胚胎发育至某个时期的时间计算，用Zeiss显微镜观察各时期胚胎特征并拍照，并统计胚胎从受精卵发育至卵裂期、囊胚期、原肠胚、神经胚、尾芽、心跳、出膜等时期所用的时间。

1.4　温度对淇河鲫胚胎受精率、孵化率以及发育速度的影响

孵化过程中定期选择不同温度一定数目的胚胎在显微镜下观察其发育情况，并统计不同温度下胚胎从一个时期发育到下一时期所用时间。在囊胚期统计不同温度下胚胎的受精率，出膜期统计孵化率，为确保准确的统计胚胎受精率，本试验另外设置没有受精的卵子作为对照。采用SPSS软件进行显著性检验，显著性水平设为0.05。

受精率=受精卵数/卵子总数×100%

孵化率=孵出仔鱼数/受精卵总数×100%

2　结果与分析

2.1　淇河鲫胚胎发育

淇河鲫胚胎发育特性与黄河鲤、异育银鲫“中科3号”类似。在水温(21±1)℃时，淇河鲫的胚胎发育经历约(71.95±0.34) h。根据其外部形态特征分为7个阶段：受精、卵裂期、囊胚、原肠胚期、神经胚期、器官形成和孵化出膜。淇河鲫胚胎发育过程中各时期特点如下：

受精卵：淇河鲫与异育银鲫同属银鲫，受精卵类似，都为黏性卵，卵质分布均匀，极性不明显(图1-1)。

桑葚胚期：在受精后，细胞开始分裂，先是一分为二，随着发育的进行，大约25 min分裂一次，在受精后(2.75±0.11)h左右，细胞越来越多，看起来状如桑葚，此时就进入了桑椹胚期(图1-2)。

囊胚期：桑椹胚期后大约0.6 h，胚胎会很快进入囊胚初期，此时细胞仍在继续分裂但此时分裂的细胞数目很难看清楚，细胞堆积在动物极一侧，占整个细胞体积的1/3左右；在桑葚胚后(4.19±0.16)h(受精后(7.01±0.05)h左右)，分裂球围绕卵黄逐渐向两侧延伸，分裂球变矮，最后像一顶帽子扣在卵黄上，此时胚胎发育便进入了囊胚晚期(图1-3)。

原肠胚期：在囊胚期后(5.55±0.18)h(受精后(12.55±0.05)h左右)，扣在卵黄上的帽子继续围绕卵黄下包，下包面积扩大至整个胚胎的1/2，至此胚盾和胚孔还未出现，此时便完成了原肠胚中期的分裂(图1-4)，在下包至2/3时，便完成了整个原肠胚的分裂。

神经胚：在原肠胚中期后(2.84±0.14)h(受精后(15.34±0.22)h左右)，胚胎经原肠胚继续发育至神经胚，此时胚层下包至胚胎的4/5，胚孔仍未完全闭合，此阶段为鱼类神经系统的发育和成熟阶段(图1-5)。

肌节出现：在神经胚后大约1.98 h(受精后17.31 h左右)，随着胚胎的继续发育，在神经胚后不久，可观察到胚孔完全闭合，在胚胎躯干中段出现了两对肌节，进入肌节出现期(图1-6)。

尾芽期：在肌节出现后神经胚后(8.65±0.12)h(受精后(25.97±0.32)h左右)，胚胎躯干部位中段可以看到四对体节，胚体尾部可看到明显的小尾巴，进入尾芽期(图1-7)。

心跳期：在尾芽期后(9.45±0.15)h(受精后(35.39±0.37)h)，在头部后方可看到心脏跳动，且随着胚胎发育的进行，心跳速度越来越快，并可清晰看到血夜循环的过程，此时进入心跳期(图1-8)。

出膜前期：在心跳期后(33±0.15)h(受精后(68.95±0.37)h)左右，胚胎在膜内不断摆动，卵膜变薄变软，此时进入出膜前期(图1-9)

出膜：出膜前期(3.55±0.13)h(受精后(71.95±0.34)h)后在头部及尾部摆动和相关酶的作用下，胚胎完成了孵化过程(图1-10)。

2.2　不同温度对淇河鲫胚胎发育影响

温度对动物胚胎发育至关重要，适宜的温度能够提升胚胎的孵化率，缩短胚胎的出膜时间。本研究设置了5个温度梯度(21、24、27、30、33 ℃)，记录不同温度条件下淇河鲫胚胎发育各阶段历时及发育完成总历时，并统计受精率与孵化率。从表1可以看出，不同温度条件对淇河鲫胚胎发育所经历的时间有显著影响，基本呈现发育时间与温度呈现负相关。但是不同温度对胚胎发育初期(受精卵到桑椹胚)的历时影响较小，而对胚胎发育后期(桑椹胚之后)所需时间影响较大(P<0.05)。同时结果显示，过高的温度(33 ℃)对淇河鲫胚胎是致命的，胚胎在囊胚期全部死亡(成活个体<5%)，可能是胚胎孵化相关酶的失活引起的。

图1　淇河鲫胚胎发育Fig.1　Embryonic development of Qihe crucian carp　　注：1.受精卵；2.桑椹胚期；3.囊胚期；4.原肠胚期；5.神经胚期；6.肌节出现期；7.尾芽期；8.心跳期；9.出膜前期；10.出膜。　　Note：1. fertilized egg；2. morula stage；3. blastula stage；4. gastrula stag；5. neurula stage; 6. sarcomere stage；7. tail-bud stage; 8. heart-beating stage; 9.pre-hatching stage; 10. Hatching stage.

2.3　不同温度下胚胎的受精率与孵化率

由图2和图3可见，在21～27 ℃，淇河鲫胚胎受精率与孵化率随着温度的升高而升高；在27～33 ℃，受精率与孵化率随着温度的升高而降低。其中，27 ℃时胚胎的孵化率显著高于其他温度(P<0.05)，而胚胎的受精率却在24 ℃时最高，但与27、30 ℃时却没有显著性差异(P>0.05)，这也说明了温度对于胚胎的受精率影响较小，而对胚胎的孵化率影响较大。

2.4　几种鲫鱼在不同温度下胚胎发育历时比较

从表2中可以看出，不同鲫鱼胚胎发育历时差别较大，但在(20±1) ℃这一温度条件下均需经历大概72 h才能完成胚胎发育、出膜，其中白鲫胚胎发育速度较快(20.5～24.5 ℃时为41.7 h)。温度对鲫鱼胚胎发育的影响是显著的，总体表现为在一定温度范围内随着温度的升高胚胎发育的时间逐渐缩短，多倍体鲫鱼对温度更加敏感。普安银鲫在18 ℃时胚胎从受精卵到出膜经历了98.7 h，而在26 ℃时只用了48.2 h。芙蓉鲫在17.5～20.5 ℃时所需时间为73.0 h，当温度升高到20.5～24.5 ℃时胚胎发育的时间缩短到44.75 h。异育银鲫“中科3号”在18 ℃需要时间94.27 h，而其在32 ℃时经历了28.47 h，这都与本研究中的淇河鲫的研究结果一致，表明了温度对胚胎发育的时间有着显著影响。

表1　不同温度下淇河鲫胚胎发育各阶段历时Table 1　The time of Qihe crucian carp embryonic development need to each stage at different temperatures

注：1. 受精卵-桑椹胚 2. 桑椹胚-囊胚晚期；3. 囊胚晚期-原肠胚中期；4. 原肠胚中期-神经胚；5. 神经胚-尾芽；6. 尾芽-心跳；7. 心跳-出膜。不同字母表示存在显著性差异(P<0.05)。

Note: 1. fertilized eggs-segmentation-sphere; 2. segmentation-sphere-late blastocyst stage; 3. blastula stage-medium of gastrula stage; 4. medium of gastrula stage-neurula stage; 5. neurula stage-tail-bud; 6. tail-bud-heart-beating; 7. heart-beating-hatching stage.Different letters represent significance at 0.05 level.

3　讨论

随着社会的发展和养殖技术的成熟，有关鱼类胚胎发育的研究越来越多，淇河鲫作为河南地区特有的鱼类，其养殖规模仍然较小，且有关其胚胎发育的研究也相对滞后。众所周知，鱼类胚胎发育易受温度、pH及盐度等外界环境因素的影响。其中温度是影响胚胎发育的重要因子，本研究中对不同温度条件下淇河鲫胚胎发育进行了观察，结果发现适宜的温度范围内，随着温度升高，淇河鲫胚胎发育完成所需要的时间缩短，但是温度过高也会影响受精率与孵化率。

图2　温度对淇河鲫胚胎受精率的影响Fig.2　Effect of temperature on embryofertilization rate of Qihe Carassius auratus注：不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)。Note：Different lowercase indicates significant difference (P<0.05).

图3　温度对淇河鲫胚胎孵化率的影响Fig.3　Effect of temperature on embryo hatchability rate of Qihe Carassius auratus注：不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)Note：Different lowercase indicates significant difference (P<0.05)

鱼类的胚胎发育过程具有相似性，但相似性度与亲缘关系有关，亲缘关系越近，其相似性也越高。通过胚胎观察发现淇河鲫胚胎发育特性与黄河鲤、异育银鲫“中科3号”类似。根据其外部形态特征分为受精阶段、卵裂阶段、囊胚阶段、原肠胚阶段、神经胚阶段、器官形成阶段和孵化出膜7个阶段，在21 ℃左右，淇河鲫的胚胎发育经历约72 h。总体来看，在胚胎发育前期，淇河鲫与异育银鲫、黄河鲤等鱼类相似。但淇河鲫也有其独特性，在神经胚、尾芽、心跳等后期发育阶段与黄河鲤、银鲫中科III号差别较大，由于淇河鲫卵膜较厚，所以在心跳期并不能像黄河鲤那样可以清楚可以看到全身血夜流动，只能看到心脏周围小部分的血液流动；同时，在心跳期之后，可以看到胚体在卵黄中转动，但在黄河鲤中并未发现这一现象[30]。这也暗示了胚胎发育后期的不同可能是造成不同鱼类差异巨大的原因，但这一推测需要进一步的验证。

表2　几种鲫鱼不同温度孵化时间的比较Table 2　Comparison of incubation temperature and incubation rime of several crucian carp

胚胎对外界温度极为敏感，温度过高或者过低，都会导致胚胎发育出现停滞或者中断。本研究通过观察不同温度下淇河鲫胚胎发育情况，发现淇河鲫胚胎在21～30 ℃都可以孵化成功，而且孵化完成所需时间随着温度的升高而缩短，这与同为三倍体的异育银鲫相似性最高[29]，但与普通的二倍体鲫鱼相差较大，推测可能四倍体彭泽鲫及经雌核发育三倍体淇河鲫、异育银鲫的胚胎对外界温度的变化更为敏感，这可能是因为卵裂初期遗传物质复制或者染色体加倍周期延长，温度条件的变化容易导致卵质中的与胚胎发育相关基因表达能力下调，信息传递途径受阻的原因[28]。

生物体内很多生化反应都是由生物酶催化的，而酶只有在最适的温度下才能发挥最强的催化作用。温度提高可以加快反应速度，但是温度过高会使酶失去活性，使体内许多生化反应停止[31～33]。硬骨鱼类中的研究发现，高温或低温对胚胎发育后期的器官分化及形成过程影响较大，因影响器官分化过程所需酶活性，导致器官分化进程紊乱致畸或者滞育，极大的阻碍了胚胎的正常发育[34]。温度对于淇河鲫胚胎的受精率与孵化率均存在明显的影响，试验过程中我们发现，没有受精的卵子仍可以进行正常分裂并发育至囊胚期，所以我们在囊胚期开始统计受精率，在囊胚之后不再分裂并且死亡的胚胎为没有受精的胚胎。33 ℃时，胚胎在囊胚期全部死亡，推测可能是温度过高影响了淇河鲫卵子受精率，但也不能排除温度过高导致胚胎发育过程中所需的酶失活，进而导致了胚胎的死亡这种可能性。其他温度下，胚胎发育进程均随着温度的升高而加快，但温度过高会影响胚胎的孵化率与受精率，推测这是由于温度过高导致胚胎发育过程中某些酶的异常工作造的。除此之外，我们发现淇河鲫胚胎在27 ℃孵化率显著高于其他温度，而受精率却在24 ℃最高，说明淇河鲫胚胎卵子最适受精温度与胚胎最适孵化温度不同。

总之，没有适宜的温度就没有生命。确定胚胎发育的合适温度对于解释其地理分布具有一定的参考价值。淇河鲫是天然雌核发育三倍体，鉴于其较高的经济价值，确立温度对淇河鲫胚胎发育及受精率与孵化率的影响，可以为生产上淇河鲫苗种培育提供一定的理论指导，也可以为后续的生产提供参考。

4　结论

淇河鲫胚胎发育历时与温度有一定相关性，在21～30 ℃都可以孵化成功，而且孵化完成所需时间随着温度的升高而缩短；但是由于温度升高对胚胎受精率和孵化率产生影响，所以生产上为了提高效益可以在早期采用24 ℃孵化，保证较高的受精率；随后采用27 ℃孵化，提高孵化率。