间充质干细胞制剂保存稳定性探索

娄云云

（协和干细胞基因工程有限公司，天津 300384）

间充质干细胞具有自我更新和多向分化以及强烈的免疫调节功能，同时，其免疫原性低，在治疗多种血液病的异基因造血干细胞移植后发生的移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、糖尿病、克隆氏病等疾病治疗中均显示出良好效果[1-2]。脐带间充质干细胞的来源为易得、变废为宝的脐带，因而受到越来越多研究者的关注，并大量从基础研究转入临床应用。临床使用细胞产品其治疗的有效成分为鲜活的干细胞，就必须从其生产，保存，运输等所有环节保证干细胞的活性，因而我们专门针对脐带间充质干细胞制剂保存的质量参数做了试验。

1 材料及方法

脐带组织块贴壁培养法分离培养人脐带间充质干细胞，经培养提取后，置于含2%人血白蛋白、65 IU/mL低分子肝素钙和复方电解质注射液的干细胞保存液，制成脐带间充质干细胞注射液三批成品，标记为17121801、17121802、17121803。分别在室温（23 ℃）和4 ℃条件下保存。并均于0、2、4、6、8、10、12 h和24 h抽样，对其进行物理检查和细胞存活率测定，并进行无菌检测。

2 试验检测

性状：目测应无色均匀细胞悬液，无明显沉淀，无异物为合格。

细胞活率检测：采用Count star自动细胞计数仪进行细胞计数；台盼蓝拒染法进行活率测定，应不低于90%。

无菌检测：按梅里埃Bact/Alert 3D 120型全自动血培养无菌检测系统进行检测，上机培养7天，结果应为阴性。

计算细胞活率：细胞存活率计算采用计数300个细胞，其中活细胞所占的比率。每组重复5次，取平均值和标准差。以方差分析进行组间数据平均值统计，两两比较采用q检验。其中P＜0.05表示差异有显著性，P＜0.01表示差异有极显著性。

3 实验数据结果对比

3.1 性状、无菌检测结果

两种保存温度下，不同保存时间的3批次制剂性状均无明显变化为合格，无菌检测结果均为阴性。

3.2 细胞活率检测结果

在室温条件下，3批样品0～6 h细胞活率降低缓慢，活率均在90%以上。而6 h之后细胞活率降低较快且低于90%，为不合格。

在4℃条件下保存24 h，细胞存活率可维持在90%以上，随保存时间延长而逐渐降低。保存前后物理检查及无菌检测结果稳定，均无异常。结果详见表1。

4 结论

3批样品在室温条件下保存24 h，性状、无菌指标均无明显变化。0～6 h细胞活率降低缓慢，且活率均在90%以上。而6 h之后细胞活率降低较快且不合格。而在4 ℃保存24 h存活率可维持在90%以上，随保存时间延长而逐渐降低。保存前后物理检查及无菌检测结果稳定，均无异常。因此，可定脐带间充质干细胞注射液保质期为24 h，保存温度为4 ℃。

表1 细胞活率检测结果

[1]Subbanna PK. Mesenchymal Stem Cells for Treating GVHD: in-vivo fate and Optimal Dose[J]. Med Hypotheses, 2007.69(2):469-670.

[2]Tyndall A, FA Houssiau. Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Autoimmune Diseases[J]. Ann Rheum Dis,2010,69(8):1413-1414.