不同贮存温度对人血白蛋白PKA影响探讨

管红玲，陈继锋，周仁花

（广东卫伦生物制药有限公司，广东汕头 515000）

激肽释放酶原激活剂（prekallikrein activator，简称PKA）是血浆中凝血因子XII被表面激活而释放出的激肽释放酶限制性蛋白酶，主要含α因子XIIa及β-XIIa肽段，是一种水解蛋白[1]。PKA能激活激肽释放酶原（PK）使其转变为激肽释放酶K后水解了高分子激肽原（HMWK），并释放出具有生物活性的激肽（BK）。BK具有导致局部疼痛，引起水泡、呼吸加速，尤其突出的临床反应是具有舒缓、扩张血管降低血压的作用[1]。人血白蛋白的临床主要应用于严重失血性创伤及烧伤所引起的低血容量休克，治疗肾病或白蛋白缺乏所引起的水肿等。当人血白蛋白中的PKA含量过高时或不合格，会在输注时出现血压下降的不良反应[2]。所以PKA是血液制品生产工艺中必须控制的质量指标，以确保患者的用药安全，《中国药典》人血白蛋白的PKA控制标准≤35IU/mL[3]。

PKA的产生是开始采集血浆时启动，凝血反应也随即产生，而添加的枸椽酸钠抗凝剂未跟血液充分混匀，使用的器具未硅化等，人血浆在冷链运输、贮存温度不当引起反复冻融、以及在生产控制过程过于追求产量而杂质高都将提高PKA水平[4]。本文设计了PKA对热敏感性研究，并将3组样品分别放置在2～8℃、20～25℃、29～31 ℃条件下贮存，以研究不同贮存温度对PKA的影响，为人血白蛋白控制PKA含量设计工艺研发路线、设计产品贮存条件及运输温度提供参考依据。

1 试验仪器和材料

1.1 样品加温、检测设备

1.1.1 恒温水浴锅

型号：CS501-3C；温度范围：R.T +5～95℃；温度波动度：±0.5℃；厂家：北京卫星制造厂；要求：应对恒温水浴锅进行校准，温度波动度在±0.5℃范围内，在校准有效期内使用；用途：对样品进行62℃、2h，63℃、2.5h的恒温。

1.1.2 酶标仪

型号：ELx800；精度范围：分辨率为0.001 OD，线性≥0.99，OD重复性为±0.005 OD（即≤0.010 OD），OD准确性为±0.010 OD（即≤0.020 OD），波长范围为400～750 nm，动态范围0～3.0 OD；厂家：美国伯腾仪器有限公司；要求：应对酶标仪进行校准，在校准的有效期内使用；用途：检测血液制品的激肽释放酶原激活剂PKA含量。

1.1.3 二等标准水银温度计

测量范围：-30～20℃；精密度：0.1℃；厂家：常州双环热工仪表有限公司。

1.2 检测试剂

激肽释放酶原激活剂（PKA）国家标准品（中国药品生物制品检验所），前激肽释放酶（PK）试剂（成都协和生物技术中心），激肽释放酶显色底物（S-2302）。

1.3 检测方法

采用显色底物法（或显色基质法）测定[3]。

1.4 样品要求

本次研究的样品是由广东卫伦生物制药有限公司生产，是以合格的单人份血浆为原料，采取经典的Cohn低温乙醇法中提取人血白蛋白，通过超滤脱醇、添加辛酸钠保护剂配制成为20%（10g）蛋白质溶液，通过60℃、10h及除菌灌装在50mL玻璃瓶中再经29.5～30.5℃孵育14天即为研究样品。

1.5 恒温室要求

1.5.1 三星冰箱

温度控制：2～8℃；设置温度：5℃，上限设置为7℃，下限设置为3℃。

1.5.2 药品稳定性实验箱（2个）

设备型号为LHH-150SD，温度偏差≤±1.0℃，湿度偏差≤±3.0%，温度均匀度≤1.0℃，湿度均匀度≤5.0%。

2 方法

2.1 方法设计

广东卫伦生物制药有限公司人血白蛋白贮存温度2～30℃，有效期3年。故本次研究将人血白蛋白完成从原料血浆投料至超滤脱醇后配制成半成品，经60℃、10h巴氏灭活开始设计PKA对热敏感研究方案，分别设计了2～8℃、20～25℃、29～31℃贮存条件。本次设计了A、B、C三组样品考察，2～8℃样品放置在冰箱，20～25℃、29～31℃样品放置在稳定性实验箱，分别考察36个月。

2.1.1 A组

取3批人血白蛋白在完成60℃、0h巴氏灭活前（A1样品）、60℃、10h巴氏灭活后（A2样品），产品除菌灌装（A3样品）并经29.5～30.5℃孵育14天为0月计分别取样检测PKA含量，将3批样品放置在2～8℃中，并分别于3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月和36个月取出样品检测PKA含量，对检测结果进行统计分析。

2.1.2 B组

取3批人血白蛋白在完成60℃、10h巴氏灭活前（B1-1/B2-1）、60℃、10h巴氏灭活后（B1-2/B2-2），除菌灌装后（B1-3/B2-3）并经29.5～30.5℃孵育14天为0月计分别取样检测PKA含量，将3批样品放置在20～25℃（B1）、29～31℃（B2）稳定性实验箱中，并分别于3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月和36个月取出样品检测PKA含量，对检测结果进行统计分析。

2.1.3 C组

取3批人血白蛋白在完成60℃、10h巴氏灭活（C1-1/C2-1样品），除菌灌装后（C2组）取样品放置在CS501-3C恒温水浴锅62℃恒温2h[4]（C1-2/C2-2样品），经29.5～30.5℃孵育14天计为0月（C1-3/C2-3样品）。分别取样检测PKA含量，将3批样品经放置20～25℃（C1样品）、29～31℃（C2样品）稳定性实验箱中，并分别于3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月和36个月取出样品检测PKA含量，对检测结果进行统计分析。

2.2 PKA检测方法

采用显色底物法，用紫外-可见分光光度法在波长405 nm处测定供试品吸光度，计算PKA含量[3]。

3 结果与分析

3.1 A组结果

A组设计方案从表1可见，人血白蛋白在经60℃、10h巴氏灭活后较灭活前的PKA值平均下降了43.5%，但经29.5～30.5℃孵育14天后较灭活后PKA值平均回升50%，在2～8℃贮存36个月考察期间，PKA控制值出现缓慢上升又下降趋势，但均符合国家标准≤35IU/mL，结果表明60℃、10h巴氏灭活及贮存温度、时间对控制PKA是一定有影响。

从A组结果中可见人血白蛋白在经60℃、10h巴氏灭活后较灭活前、以及在经29.5～30.5℃14天孵育后较灭活后的PKA值控制值有下降及回升的过程。

3.2 B1、B2组方法结果

3.2.1 B1组结果

将样品放置在20～25℃贮存考察36个月按表2取样周期分别检测PKA值，可见PKA控制值出现缓慢上升又下降趋势（见图1），分水岭在3个月开始逐渐下降，并均符合国家标准≤35IU/mL，结果表明60℃10h巴氏灭活、提高贮存温度可降低PKA值。

图1 B1组方案人血白蛋白PKA结果（贮存条件20～25℃）

3.2.2 B2组结果

将样品放置在29～31℃贮存36个月考察期间按表3取样检测PKA值，出现PKA控制值缓慢上升又下降趋势(见图2)，分水岭在3个月开始逐渐下降，并均符合国家标准≤35IU/mL，结果表明60℃、10h巴氏灭活、提高一定的贮存温度可降低PKA值。

图2 B2组方案人血白蛋白PKA结果（贮存条件29～31℃）

表1 A组方案人血白蛋白PKA结果（贮存条件2～8℃）(单位：IU/mL)

表2 B1组方案人血白蛋白PKA结果（贮存条件20～25℃）(单位：IU/mL)

表3 B2组方案人血白蛋白PKA结果（贮存条件29～31℃）(单位：IU/mL)）

3.3 C1组、C2组方法结果

3.3.1 C1组方法结果

从表4、图4可见，人血白蛋白在经60℃、10h巴氏灭活继续进行62℃、2h较灭活前的PKA值平均下降了82.6%，但经29.5～30.5℃孵育14天后较灭活后PKA值平均回升150%，样品放置在20～25℃贮存36个月考察期间按表4取样检测PKA，发现PKA同样出现缓慢上升又下降趋势见图3，并在3个月开始逐渐下降，并均符合国家标准≤35IU/mL，结果表明提高巴氏灭活温度、延长灭活时间、提高贮存温度可明显降低PKA含量。

图3 C1组方案人血白蛋白PKA结果

图4 C组方案人血白蛋白PKA结果（贮存条件29～31 ℃）

表4 C1组方案人血白蛋白PKA结果（60℃10h+62℃2h贮存条件20～25℃）(单位：IU/mL)

表5 C2组方案人血白蛋白PKA结果（60℃10h+62℃2h贮存条件29～31℃）(单位：IU/mL)

3.3.2 C2组方法结果

从C1级方案可见人血白蛋白在经60℃10h巴氏灭活继续62℃2h较灭活前、经29.5～30.5℃孵育14天后较灭活后的PKA值有大幅度的下降及回升趋势，样品放置在29～31℃贮存36个月考察期间按表5取样检测PKA值，PKA控制值同样出现缓慢上升及下降趋势（见图4），并在3个月开始出现下降趋势，并均符合国家标准≤35IU/mL，结果表明在同等巴氏灭活条件下、延长灭活时间、提高一定贮存温度可明显降低PKA含量。

4 讨论

A组、B组研究结果表明血浆中的PKA在经过60℃高温后平均可以灭活43.5%PKA，但进行29.5～30.5℃孵育14天工序后PKA水平较巴氏灭活后增加了50%。C组结果表明当60℃10h巴氏灭活再继续62℃2h加温后PKA含量较A组、B组平均下降60%水平，但同样进行29.5～30.5℃孵育14天工序后PKA水平较巴氏灭活后增加了150%。陈通威等报道[4]，PKA对热非常稳定，60℃或提高温度或时间无法有效灭活PKA。

通过对人血白蛋白36个月PKA水平的考察发现，A组在2～8℃贮存过程中PKA含量在逐渐上升直至30个月后，PKA方有下降趋势，证实了Suontaka 等[5]报道，输血用血浆在4℃保存期间发生冷激活，在冷激活中激肽释放酶样活性增加。B1组、B2组分别在20～25℃、29～31℃贮存过程中PKA含量3个月内在逐渐上升，3～9个月有一个水平平稳过程后又逐渐下降。C1组、C2组的研究结果也证实了这一点。也就是说通过高温后的PKA未能有效灭活，但产品贮存在20～30℃激肽释放酶的活性在降低。从考察结果来看，B组与C组PKA水平实际上无明显差异。

控制血浆中PKA水平应该从原料血浆的采集、严格控制运输及贮存温度、控制好生产过程反应温度及PH值，也可采取硅藻土吸附的方法[6]。采取巴氏灭活、提高巴氏灭活温度或延长时间的方法来降低PKA水平，会对蛋白质的稳定性和纯度有一定的影响[7]。

综上所述，人血白蛋白中PKA选择适宜的贮存温度可降低未能灭活的PKA含量，本次研究为卫伦生物制药有限公司制定控制PKA生产工艺路线、设计原料血浆及产品运输、贮存温度，提高产品质量的目的具有很大的意义。

[1]潘传涌,时多,缪明永,等.激肽系统活性产物[J].生命的化学,2008,28(5):629-632.

[2]王卓,赵雄,吕茂民,等.血液制品的现状与展望[J].生物工程学报,2011,27(5):730-746.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[4]陈通威,胡明明.降低人血白蛋白制品中PKA方法初探[J],中国医药生物技术,2013,8(6):463-465

[5]Suontaka AM, Silveira A, Söderström T, et al. Occurrence of cold activation of transfusion plasma during storage at +4 ℃[J]. Vox sang,2005,88(3):172-180.

[6]周满祥,杨向明,申云飞,等.人血白蛋白制品中激肽释放酶原激活剂的控制方法:中国,CN103087184A[P].2013-05-08.

[7]吴敬林.不同条件巴氏消毒和热稳定性试验对人血白蛋白多聚体的影响[J].医学杂志,2000,9(6):874-875.