乙型脑炎灭活疫苗下游纯化工艺研究

李旭，徐威，于海，陈志成

（1.沈阳药科大学，辽宁沈阳 110016；2.辽宁成大生物股份有限公司，辽宁沈阳 110179）

Vero细胞是世界卫生组织（WHO）推荐制备疫苗的常用细胞基质，用于疫苗生产能克服原代细胞疫苗的很多缺点，已经成功地应用于狂犬病疫苗、乙脑疫苗、流感疫苗、EV71疫苗等的生产中。由于Vero细胞是来源动物组织的传代细胞，用其生产疫苗的原液中含有少量Vero细胞膜蛋白和结构蛋白[1]，这些细胞蛋白会对人体健康可能产生潜在影响，《中国药典》三部（2015版）中对宿主蛋白杂质含量有严格规定，要求乙脑疫苗成品宿主蛋白残留量小于2 µg/mL[2]。目前，在疫苗制备过程中通常使用Sepharose系列凝胶，利用病毒与杂质分子量不同的特点，使用分子筛原理纯化病毒。

新型凝胶Capto Core700是一种复合模式介质（如图1所示），以核心微球技术为基础，介质表面是5 μm厚度的凝胶层，空间间隙为相对分子质量（Mr）约700 000的孔环绕成的球体，球体内部为带有锌氨基配基的正电荷分子。在纯化过程中，相对分子量小于700 000的生物分子将进入孔内，带负电的杂质会被其吸附，利用病毒分子从外水体积通过，杂质被介质吸附的方法，达到去除杂质的目的[3]。本实验应用CaptoCore700复合介质使乙脑病毒分子经过凝胶表面流过，宿主蛋白等小分子杂质被凝胶内正电荷基团吸附，达到分离效果[4]。

图1 CaptoCore结构

1 材料与方法

1.1 毒株及细胞

P3株乙脑病毒，源自北京生检所；Vero细胞，源自美国ATCC/WHO。

1.2 主要试剂及仪器

复合凝胶CaptoCore700和AKTA avant150层析系统，购自美国GE公司；Vero细胞宿主蛋白检测试剂盒，购自北京天坛生物制品股份有限公司；5 L的celligen plus 生物反应器，购自美国NBS公司；微载体，购自美国GE公司；0.8μm孔径滤芯，购自赛多利斯公司；300kD的膜包，购自密理博公司；β-丙内酯，购自Sigma公司。

1.3 病毒原液的制备

Vero细胞接种至微载体，在Celligen plus生物反应器中于37 ℃培养6天；长满微载体表面，降温至33 ℃，按MOI 1:500的比例接种P3株乙脑病毒，感染2 h；灌流病毒维持液48h；收获病毒，至微载体上细胞汇合率为15%时停止收获。连续制备10批，批号为J1701～J1710。

1.4 病毒灭活

将病毒原液经0.8 μm孔径滤芯澄清，再经过300 kD的膜包浓缩约20倍，获得病毒浓缩液；病毒浓缩液加入1/4 000体积的β-丙内酯，于2～8 ℃件下灭活病毒24 h，获得病毒灭活液。

1.5 疫苗的纯化

将装载复合凝胶CaptoCore700的纯化柱用缓冲液（10 mmol/L PBS，pH 7.3～7.4）平衡40个柱体积。上样病毒灭活液，上样体积控制在3个柱体积，流速75 cm/h，收集紫外吸收峰，用CIP 清洗液（1.0 mol/L NaOH）清洗纯化系统，进行凝胶再生。

1.6 中间产品成分检测

1.6.1 乙脑宿主蛋白含量检测

使用北京天坛生物制品有限公司Vero细胞残余蛋白检测试剂盒检测，方法：将样品适当稀释加至酶标板37 ℃孵育1 h洗涤，再加入酶标记物及底物液反应，酶标仪在450 nm测定吸光值与标准抗原连续稀释后绘制标准曲线比对计算结果。

1.6.2 乙脑灭活液、纯化液抗原含量检测

使用乙型脑炎病毒ELISA实验检测，方法：将样品适当稀释后加入预先包被好抗体的酶标板中37 ℃孵育90 min后清洗，再加入乙脑病毒糖蛋白单抗，之后加酶标记结合物后再次孵育、显色，用酶标仪在波长492 nm测定OD值计算样品稀释倍数。

1.7 传统Sepharose凝胶纯化方法

装载Sepharose 6FF凝胶的纯化柱用缓冲液平衡1.5个柱体积，将病毒灭活液加载到纯化介质，上样体积控制在15%个柱体积，流速20 cm/h，收集紫外吸收峰。

2 结果与分析

2.1 疫苗的纯化

10批病毒灭活液经复合凝胶Capto Core700纯化后，清晰可见紫外吸收第一峰及第二峰，分别为目标峰和杂质峰，表明该介质可有效将疫苗原液中的杂质分离，见图2。

2.2 疫苗纯化液的检测

2.2.1 Vero细胞宿主蛋白去除率

纯化后10批疫苗纯化液的宿主细胞蛋白去除率为64.48%～70.35%，平均值为67.30%，标准偏差（SD）为1.87%，平均值±3SD的范围为61.68%～72.92%，去除率均在此置信区间内，见表1。

表1 疫苗纯化液的宿主细胞蛋白去除率

图2 十批乙脑病毒液经CaptoCore700凝胶层析图谱

比较Sepharose与CaptoCore700在宿主蛋白去除方面的效果，见表2。由表2可知，P＞0.05，说明两种填料在宿主蛋白去除方面没有显著差异，宿主蛋白去除率基本一致。

2.2.2 乙脑病毒抗原回收率

纯化后10批疫苗纯化液的抗原含量的降幅见表3。比较Sepharose与CaptoCore700在抗原损失方面的效果，见表4。

由于P＜0.05，说明两种填料在抗原损失方面有显著差异，CaptoCore700相对于Sepharose，抗原损失更小，收率更高。

表2 Sepharose6FF凝胶与CaptoCore700凝胶纯化后的宿主细胞蛋白去除率

表3 疫苗纯化液的抗原含量的降幅

表4 Sepharose6FF凝胶与CaptoCore700凝胶纯化后抗原损失

3 讨论

乙型脑炎是亚洲许多国家的一种严重传染病，近年来发病率达0.09～0.1/10万，病死率为5%～35%。与其他传染病相比，乙脑的发病率虽然不高，但其患病后的后果特别严重。在中国夏、秋两季气温高、多雨潮湿容易滋生蚊蝇，是乙脑主要的流行季节，南方地区通常为6～9月，北方地区通常为7～9月。中国CDC统计，2012和2013两年内乙型脑炎发病数分别为1 767例和2 121例，其中死亡数为58例和63例，位列所有传染病死亡人数第8位。对乙脑的预防措施主要有防蚊灭蚊以及人群的疫苗免疫接种两种手段，其中接种乙脑疫苗是最重要的措施[5]。

乙脑病毒呈球状，直径35～50nm，衣壳呈20面立体结构[6]。外有包膜，基因组为单股正链RNA。乙脑病毒分为5种基因型，分别是1型、2型、3型、4型和5型。基因组编码10种蛋白，包括3个结构蛋白基因（衣壳蛋白C、膜前蛋白PrM和囊膜蛋白E）和7个非结构蛋白基因（糖蛋白NS1和NS2a，蛋白酶协调因子NS2b，蛋白酶和螺旋酶NS3、NS4a和NS4b以及RNA聚合酶NS5）[7]。

其中囊膜蛋白E（简称JEV E蛋白）具有血凝活性和中和活性，是病毒表面最重要的成分，它与病毒的吸附、穿入、致病和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。乙脑疫苗的效价主要取决于JEV E蛋白的含量和空间构象。在疫苗生产中，乙脑病毒在细胞中复制、组装过程中会产生一些游离的小分子JEV E蛋白，这些小分子由于未结合在完整病毒颗粒上，其免疫原性低。在纯化过程中，去除游离的小分子JEV E蛋白颗粒可提高疫苗效价。

本实验采用Capto Core700凝胶纯化灭活液，抗原含量损失更小，收率更高。CaptoCore700复合凝胶对10批灭活液纯化的宿主蛋白去除率为64.48%～70.35%，与传统Sepharose系列凝胶纯化宿主蛋白去除率64.50%～73.40%相比基本一致。但利用Capto Core700凝胶可将纯化灭活液的上样体积由15%柱体积提高至300%柱体积。

由于CaptoCore的结构特点，纯化过程中分子量较小的组分很容易进入胶粒中心区被带电基团吸附，所以理论上相对分子质量（Mr）小于700 000且带有负电荷的的杂质成份如宿主细胞DNA小分子、牛血清白蛋白及细菌内毒素更易被分离，但由于本实验时间有限不能对其他杂质去除进行逐项检测，本课题组将在今后做进一步研究。

综上所述，CaptoCore700凝胶具有上样量高、处理量大、缩短了工艺时间；保留抗原同时有效去除了宿主蛋白杂质。

[1]Barrett PN, Mundt W, Kistner O, et al. Vero Cell Platform in Vaccine Production: Moving Towards Cell Culture based Viral Vaccines[J].Expert Rev Vaccines, 2009,8(5):607-618.

[2]国家药典委员会.中国药典.三部[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[3]马志宇,陈美丽,张萌,等.Capto Core700在流感疫苗中去除卵清蛋白的应用[J].中国生物制品学杂志2013,5(26):723-725

[4]姜英,韩平,胡广宏,等.复合模式介质Capto Core700纯化轮状病毒[J].中国生物制品学杂志,2015,1(28):72-78.

[5]Campbell, Grant L,Hills, Susan L, et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review[J].Bulletin of the World Health Organization,2011,89(10):766-774.

[6]王军志.疫苗的质量控制与评价[M].北京:人民卫生出版社,2013:402-407.

[7]蔡宝祥.我国流行性乙型脑炎研究近况[J].畜牧与兽医,2012,44(7):1-5.