一株浒苔拉乌尔菌HT15-8的菌种鉴定及其抗肿瘤活性初步研究

苑志欣，李荣贵，郑兰红

（1.青岛大学 生命科学学院，山东青岛 266071；2. 农业农村部极地渔业开发重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛 266071）

海洋微生物作为抗肿瘤活性物质的新来源，已经 受到了全世界海洋研究工作者的关注。浒苔是一种重要的海洋资源，含有丰富的碳水化合物、氨基酸、微量元素、维生素和脂肪酸等营养物质，具有降血糖、抗菌消炎、抗肿瘤活性、提高免疫力的作用[1]。本研究采用细胞毒活性检测法，从浒苔共生菌中筛选出一株具有抗肿瘤活性的菌株Raoultella sp. HT15-8，对其次级代谢产物进行了初步的分离纯化，得到的抗肿瘤粗提物对两种肿瘤细胞都具有良好的抗肿瘤活性。本文结合具体实验与分析方法作一探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培养基

Raoultella sp.HT15-8，由本实验室从青岛海域的浒苔中分离得到。发酵培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，pH=7.5，121 ℃灭菌30 min。

1.1.2 细胞培养

人肝癌细胞BEL-7402、人非小细胞肺癌细胞A549均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；人肝癌细胞BEL-7402细胞采用DMEM高糖培养基，人非小细胞肺癌细胞A549采用RPMI1640培养基；将各肿瘤细胞接种于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM、RPMI1640培养 液 中，置 于37 ℃、5%CO2培养箱内培养。

1.1.3 主要试剂

RPMI1640、DMEM、PBS、胰蛋白酶、进口胎牛血清、DMSO，购自Solarbio公司；16S rRNA通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成；PCR扩增相关试剂和核酸Marker，购自索莱宝生物工程公司；MTT，购自Sigma公司；微孔滤膜，购自美国Pall公司；甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、Tris、盐酸等常用试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水和蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选

从青岛海域捞取新鲜浒苔沥干，将其研磨粉碎成浆，分别采用海水基础培养基2216E、LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基等对浒苔样品进行多次选择性的稀释、涂布、划线和分离培养，共获得10株单菌落。

1.2.2 菌种鉴定

（1）形态观察。将活性初筛得到的HT15-8接于牛肉膏蛋白胨平板上，30 ℃静置培养24 h后，体式显微镜下观察菌落及子实体形态。

（2）生理生化特征观察。采用API 20E肠杆菌和其他革兰阴性杆菌鉴定系统和API 20NE非肠道革兰阴性杆菌鉴定系统和氧化酶试纸测定生理生化特征。

1.2.3 倒置显微镜观察活性组分对细胞形态的影响

取对数生长期的细胞，将细胞制成浓度为4×104个/mL的细胞悬液，均匀铺在96孔培养板中，每孔加入180 µL，置于CO2恒温培养箱中37 ℃培养24 h。参考MTT实验结果加样，4个平行孔，每孔加入20µL样品，对照组加入无菌水，在37 ℃恒温培养箱中继续培养12 h、24 h、36 h后，取出放置在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并拍照记录。

1.2.4 活性粗提物的分离纯化

（1）菌株的发酵培养。将实验室保藏的菌株HT15-8先转接到固体培养基活化后，用接种环挑取单菌落接种于4 mL种子培养基中，于30 ℃、200 r/min的摇床中恒温培养12 h，即为种子培养液；然后按照4%的接种量将活化后的种子培养液转接于含发酵培养基400 mL的大摇瓶中，离心去菌体收集上清发酵液。

（2）有机溶剂萃取。将各菌株发酵液在12 000 r/min条件下离心20 min后收集上清液，超滤浓缩后加入等体积的有机溶剂甲醇、丙酮、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取，每次萃取4 h，多次萃取后收集上层有机相，然后利用旋转蒸发仪将收集到的萃取相在60 ℃条件下减压蒸干。减压蒸干的样品经重溶、离心、冻干后，检测发酵活性组分的抗肿瘤活性。

（3）离子交换色谱分离。将得到的活性组分用尽量少的Tris-HCl缓冲液复溶后，进行离子交换色谱分离。采用阳离子交换色谱柱CM柱进行交换分离，将收集到的样品进行透析除盐冻干，分别测定其细胞毒活性。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

初筛实验表明，对肝癌细胞BEL-7402的抑制率达到50%以上的浒苔共生微生物有4株，其中HT15-8菌株的发酵液具有最强的肿瘤细胞增殖抑制作用，并将该菌株于2016年9月30日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM2016507。

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态特征

HT15-8菌落呈圆形，表面光滑湿润，易挑起，菌落质地均匀，正反面、边缘以及中央部分的颜色很均一，菌落颜色为乳白色，属于革兰氏阴性菌。

2.2.2 生理生化特征

HT15-8的生理生化特征实验结果见表1，脲酶、色氨酸脱氢酶、明胶酶均显示阴性；β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、H2S产生、吲哚实验、VP实验、氧化酶试验均显示阳性。

表1 Raoultella sp. HT15-8菌株的生理生化特征

2.2.3 系统发育树的构建

对HT15-8进行琼脂糖凝胶电泳，结果有亮色条带出现，说明PCR成功，可用于后续测序。在NCBI上经过BLAST分析，结果表明HT15-8属于拉乌尔菌属，命名为Raoultella sp. HT15-8，与Raoultella planticola ATCC 33531在同一分支上，在进化位置上最为接近。利用Mega 6.0的Kimura-2-Parameter模型，运用邻接法（NJ）构建系统发育树。

2.3 活性粗提物的纯化

2.3.1 萃取分离

菌株HT15-8发酵液经不同有机溶剂萃取后，对BEL-7402肿瘤细胞进行细胞毒活性检测，其中甲醇、丙酮和乙酸乙酯对发酵液中目的产物的抗肿瘤活性影响较大，而正丁醇对发酵上清液的抗肿瘤活性影响较小，可以很好地将目的产物萃取出来。

萃取组分300μg/mL 甲醇 甲醇 正丁醇 乙酸乙酯抑制率/% 21 13 74 22

2.3.2 离子交换色谱分离抗肿瘤活性物质

将萃取得到的粗提物用尽量少的水复溶后，进行离子交换色谱分离。分别用阴离子交换色谱HiTrap DEAE FF、HiPrep Q FF 16/10和阳离子交换色谱HiTrap CM FF置换分离，结果显示阳离子色谱HiTrap CM FF可以较好地将目的产物置换出来。得到的分离结果如图1，共收集到3个穿透峰，只有峰P3的冻干液有活性。

图1 离子交换色谱分离抗肿瘤活性组分

2.3.3 粗提物的抗肿瘤活性

将HiTrap CM FF离子交换色谱所分离得到的活性粗提物浓缩成一定浓度，分别作用于BEL-7402和A549，无菌水作为阴性对照，相同条件下作用24 h后，可以观察到对照中的肿瘤细胞正常生长，不受任何影响。而加药组的肿瘤细胞增殖受到抑制，均出现变圆皱缩聚团现象，同时部分细胞还出现裂解凋亡状态。

图3 活性粗提物对BEL-7402和A549作用24h后的形态变化

3 讨论

随着人们生活质量的提高和对身体健康的日益重视，对于开发高效、低毒的小分子抗肿瘤药物的需求也变得日益迫切。本实验以浒苔为研究对象，对10株浒苔共生微生物进行发酵培养，采用细胞毒活性（MTT）法，对代谢产物进行了抗肿瘤活性的重点筛选，从倒置显微镜下观察分析发现，浒苔拉乌尔菌Raoultella sp. HT15-8代谢产物的活性组分能够明显抑制肿瘤细胞的正常增殖并最终导致其凋亡[2]。通过对菌株HT15-8进行形态观察、生理生化实验鉴定和16S rRNA基因序列同源性分析，发现为拉乌尔菌属（Raoultella sp.），通过倒置显微镜观察菌株Raoultella sp. HT15-8代谢产物的活性组分对 BEL-7402、A549细胞形态的影响，结果显示株菌HT15-8的活性组分可以改变肿瘤细胞形态，抑制肿瘤细胞增殖。

进一步采用水饱和正丁醇萃取制备浒苔微生物的代谢产物，随后通过阳离子交换色谱HiTrap CM FF对该粗提物进行蛋白分离纯化，得到1个较纯的单峰物质，体外肿瘤细胞实验结果显示该组分具有广谱高效的抗肿瘤活性。该实验表明，HT15-8有开发成抗肿瘤新药物的潜在价值，为新型先导化合物的发现提供了新的微生物种质资源。

[1]曹雪,杨瑞丽,袁献温,等.海洋放线菌ACMA006抗肿瘤活性成分的分离纯化及结构鉴定[J].台湾海峡,2011，30(3):400-404.

[2]孙坤来,王义,付鹏,等.浒苔共生真菌HT-2次生代谢产物的研究[J].中国海洋药物,2013,32(1):37-45.