基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌

余佳佳， 刘婧娴， 李媛睿， 俞 静， 刘 瑛

（上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092）

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科细菌中常见的病原菌之一，临床分离率高达14%[1]。目前肺炎克雷伯菌的耐药形势越来越严峻，对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率在10%以上[1-2]。对于此类耐药菌，经验性单一抗菌药物的使用可能会导致抗感染治疗失败[3]。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）的主要耐药机制是产碳青霉烯酶。我国流行的CRKP 70%以上为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌[4-5]。因此，及时、快速地检测该型别肺炎克雷伯菌对指导临床抗菌药物的使用和控制院内耐药性的传播有重要意义。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近几年来用于微生物鉴定的有效工具，因具有快速、简便等优点使其在临床微生物实验室得到广泛应用。根据国外文献报道，MALDITOF MS除了可以用于细菌种属鉴定外，还具有鉴别亚型的潜力[5-9]。本研究旨在利用MALDITOF MS筛选出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰，从而在微生物实验室临床常规鉴定工作中可快速检测该型别肺炎克雷伯菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 选取2009—2016年上海交通大学医学院附属新华医院微生物实验室前期收集并已进行碳青霉烯酶基因检测以及多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）的肺炎克雷伯菌207株，其中118株（ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌67株，非该型别的肺炎克雷伯菌51株）作为特异峰筛选组；89株（ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌37株，非该型别的肺炎克雷伯菌52株）作为特异峰验证组，其中9株产KPC-2肺炎克雷伯菌由复旦大学附属华山医院（5株ST423型，2株ST65型，1株ST11型）和上海交通大学附属儿童医院（1株ST11型）提供。随机收集2016年10月—2017年2月MALDI-TOF MS鉴定结果为肺炎克雷伯菌且质谱评分＞2.00的临床分离菌95株，用于评估特异峰的临床应用价值。

1.1.2 试剂和仪器 甲酸和乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA）基质和标准蛋白校准品购自德国Bruker Daltonik公司；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物购自生工生物工程（上海）有限公司，PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。Microflex LT质谱仪、96孔金属靶板、Flex control 3.0软件、MicroFlex Biotyper 3.0鉴定分析软件、Clinpro Tools 3.0软件以及Flex analysis 3.0图谱分析软件均购自德国Bruker Daltonik公司；Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR仪和微量移液器购自德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 特异峰筛选试验 （1）质量图谱的获取：将-80 ℃保存的118株肺炎克雷伯菌在室温下复苏后接种至麦康凯平板上，35 ℃孵育16～24 h，然后挑取单个菌落转种于血平板，35 ℃孵育16～24 h后挑取单个菌落混于70%（V/V）的乙醇溶液中，3 000×g离心5 min后去上清，在菌落沉淀中加入甲酸、乙腈混合溶液（1∶1），裂解细菌，取1 μL裂解液加入96孔靶板，自然干燥后加入1 μL HCCA基质，自然干燥后进行MALDI-TOF MS检测。利用Flex control 3.0软件获得质量图谱并保存，校准物质为标准蛋白校准品。参数设置：m/z范围2 000～20 000，shots 200，激光强度80%。将图谱导入MicroFlex Biotyper 3.0鉴定分析软件，与数据库进行比对，当鉴定结果为肺炎克雷伯菌且质谱评分＞2.30时，再利用Flex analysis 3.0图谱分析软件对质谱峰图进行曲线光滑去噪及基线去除处理。（2）特异峰的筛选：将118株肺炎克雷伯菌中67株ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的图谱作为A组，51株非该型别的肺炎克雷伯菌的图谱作为B组，导入Clinpro Tools 3.0软件，进行统计学分析，获得按照统计学意义排列的质量峰列表；绘制排名前5位质量峰的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，比较曲线下面积（area under curve，AUC）；通过主成分分析（principal component analysis，PCA）获得A组和B组的散点分布图，综合以上条件确定ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的最特异峰，并通过Flex analysis 3.0图谱分析软件对挑选出的特异峰进行肉眼观察。

1.2.2 特异峰验证和重复性试验 按照上述操作步骤获得特异峰验证组89株肺炎克雷伯菌的质量图谱，导入Flex analysis 3.0图谱分析软件。采用肉眼观察特异峰的方法对菌株进行分类，并从中随机挑选出60株肺炎克雷伯菌（ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌及非该型别肺炎克雷伯菌各30株）。在血平板上获得新鲜菌落后，挑取3个单菌落分别进行裂解，取1 μL单菌落的裂解液点样在金属靶板孔位上，分别在每个孔位的3个不同位置获取图谱，则1株菌共有9个质量图谱，将图谱导入Flex analysis 3.0图谱分析软件，肉眼观察是否存在特异峰，计算特异峰的重复性。

1.2.3 临床应用评估 随机收集2016年10月—2017年2月日常工作中MALDI-TOF MS鉴定结果为肺炎克雷伯菌且质谱评分＞2.00的临床菌株95株，观察其临床鉴定图谱是否具有特异峰，并对所有菌株进行碳青霉烯酶基因检测和MLST，从而计算特异峰的特异性和敏感性。

1.2.4 碳青霉烯酶基因检测和MLST 利用PCR检测用于临床评估的95株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因blaKPC-2、blaGES、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2、blaNDM-1和blaOXA-48[10]，并对阳性扩增产物进行测序，测序结果提交美国国立生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站进行Blast比对。根据MLST网站（http：//bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）的推荐，采用PCR检测肺炎克雷伯菌的7个管家基因，即gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB，对扩增产物进行测序，测序结果与MLST databases进行比对后获得等位基因组合所对应的ST型。

1.3 统计学方法

采用Clinpro Tools 3.0软件进行统计分析，数据用表达，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 特异峰筛选

特异峰筛选组菌株的碳青霉烯酶基因类型和MLST见表1。118株肺炎克雷伯菌的图谱在Clinpro Tools 3.0软件中通过统计学分析获得质量峰列表，其中排名前5位的质量峰分别为m/z 4 521、4 510、2 763、6 514和4 648。排名第1位的质量峰m/z 4 521，A组平均信噪比是5.74±2.69，B组平均信噪比是0.67±0.31，二者差异有统计学意义（P＜0.01），变异系数为46.88%。质量峰的ROC曲线见图1，其中质量峰m/z 4 521的AUC最大，为1.000。虽然质量峰m/z 2 763的AUC为0.998，但由于变异系数为62.31%，统计学意义低于m/z 4 510（AUC=0.947，变异系数=31.38%）。通过主成分分析获得A组和B组的特异峰信噪比分析图（图2），图中可看出在m/z 4 521的方向，A组和B组间分界明显，而在m/z 4 510方向A组和B组有较多重合。

将特异峰筛选组菌株的质量图谱导入Flex analysis 3.0图谱分析软件，并将质量图谱进行局部放大，m/z分析范围设定为4 300～5 200，设定确认特异峰存在的条件为：信噪比＞3.000，容忍度为m/z ±3。

表1 118株特异峰筛选组菌株的碳青霉烯酶基因类型和MLST

图1 质量峰m/z 4 521、2 763、4 510、6 514和4 648的ROC曲线

图2 ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌和其他型别肺炎克雷伯菌特异峰信噪比分析

2.2 特异峰的验证和重复性试验

89株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因类型和MLST见表2。将所有质量图谱导入Flex analysis 3.0图谱分析软件，若肉眼观察存在特异峰m/z 4 521，则判断此菌株为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌，未出现该特异峰，则判断为其他型别肺炎克雷伯菌（图3）。肉眼观察特异峰分类方法的敏感性为97.3%（36/37），特异性为98.1%（51/52）。

表2 89株特异峰验证菌株的碳青霉烯酶基因型别和MLST

图3 不同型别肺炎克雷伯菌的MALDI-TOF MS质量图谱

用于重复性分析的30株ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌共有270个质量图谱，其中有7个图谱（分别属于不同的菌株）无特异峰m/z 4 521，其余263个图谱均有该特异峰，该特异峰重复率为97.4%（263/270）。另外30株非该型别肺炎克雷伯菌的270个质量图谱均无特异峰m/z 4 521。

2.3 临床应用评估

2016年10月—2017年2月共收集了95株肺炎克雷伯菌及其临床鉴定图谱，菌株的碳青霉烯酶基因和MLST检测结果见表3，其中ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌32株，非该型别肺炎克雷伯菌63株，肉眼观察临床鉴定图谱是否存在特异峰m/z 4 521的方法对ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌进行鉴别的特异性为95.2%（60/63），敏感性为96.9%（31/32）。

表3 95株临床菌株碳青霉烯酶基因型别及MLST

3 讨论

碳青霉烯类药物是治疗肠杆菌科细菌重症感染的一线抗菌药物，但近年来CRKP的检出率日益增加，CRKP对包括碳青霉烯类在内的多种不同类型抗菌药物广泛耐药，从而导致临床治疗失败，严重威胁患者生命。根据耐药机制研究和流行病学分析可知，我国CRKP的主要流行株为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌。目前检测肺炎克雷伯菌产KPC-2型碳青霉烯酶的金标准是PCR，而确定其ST型则需对特定保守基因进行DNA测序，这2种方法都较为繁琐，需要特殊的试剂和仪器，且对操作人员有较高的要求，在临床微生物实验室无法得到常规开展。MALDI-TOF MS在临床微生物实验室已常规用于病原菌鉴定，具有快速、简便的优点。通过质量图谱与数据库的比对，可获得细菌的种属信息。质量图谱中包含的蛋白质的表达信息不仅可用于种属鉴定，对细菌的进一步分型也具有指导作用。

本研究采用MALDI-TOF MS对ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌和其他型别的肺炎克雷伯菌进行比对分析，筛选出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰m/z 4 521。通过对特异峰m/z 4 521进行试验验证，发现利用该特异峰检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌有很高的特异性和敏感性，并且该特异峰重复性很高，因此在日常临床工作中可根据分离菌的单个鉴定图谱是否有特异峰m/z 4 521快速检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌。该方法快速、简便且不需要增加额外的仪器、试剂、费用和工作量等。

本研究包含了各种型别肺炎克雷伯菌，除了ST11型产KPC-2、其他ST型产KPC-2、ST11型不产碳青霉烯酶以及其他ST型产其他碳青霉烯酶的CRKP外，还包括了对碳青霉烯类抗菌药物敏感的其他ST型菌株，基本包含了临床中分离的所有型别肺炎克雷伯菌。较多的菌株数量和丰富的菌株型别充分证明质量峰m/z 4 521是ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰。

本研究在进行特异峰筛选和验证试验时，对菌株孵育时间、接种平板种类、裂解方法以及质谱参数都进行了严格规定，确保获得的鉴定图谱评分＞2.30，使细菌准确鉴定至种水平。由于麦康凯平板上生长的肺炎克雷伯菌形态更易与其他肠杆菌科细菌区分，本实验室在临床日常工作中常规利用MALDI-TOF MS直接对麦康凯平板上生长的菌落进行质谱鉴定，并且根据质谱仪厂商规定，鉴定图谱评分只需＞2.00，即可将菌株鉴定至种水平，因此日常工作中质量图谱的获取很难按照试验设计的条件进行。为了确保利用特异峰m/z 4 521的存在与否来判断菌株是否为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的方法具有临床应用价值，本研究对95株肺炎克雷伯菌的常规临床鉴定图谱进行了特异峰观察，发现该方法的特异性和敏感性均＞95.0%。由此证明在临床日常工作中，即使是未按照试验条件而获取的质量图谱，也可根据特异峰m/z 4 521的存在与否，快速、准确地判断菌株是否为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌。

本研究对特异峰进行了临床应用价值评估，发现在2株ST11型不产碳青霉烯酶和1株ST29型不产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌的临床鉴定图谱中存在特异峰m/z 4 521，1株ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的临床图谱中并不存在特异峰m/z 4 521，这些菌株按照试验条件重新获取图谱后观察到特异峰，结果与临床鉴定图谱一致。本研究还对这4株菌重新进行了纸片扩散法药物敏感性试验、改良Hodge试验以及碳青霉烯酶失活试验，检测耐药表型和碳青霉烯酶活性，发现检测结果与碳青霉烯酶基因检测结果相符。由于质量峰m/z 4 521是ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰，故推测该特异峰对应的蛋白质可能参与ST11型肺炎克雷伯菌产生并分泌KPC-2型碳青霉烯酶的过程，且编码基因有可能位于质粒上，因此出现上述2种情况的原因可能是含有特异峰对应蛋白质编码基因的质粒稳定性略差，在传代过程中有可能发生丢失和传播，这还有待后续研究进一步证实。

据报道，日本学者发现产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的特异峰m/z 11 109，该特异峰的本质为PKPQIL-p019蛋白，编码该蛋白的基因与blaKPC毗邻位于PKPQIL型质粒的Tn4401转座子内[11-12]。但该质粒仅在日本流行，在其他地区流行的不携带该质粒的产KPC肺炎克雷伯菌无法检测到该特异峰[13]。在本实验室获得的鉴定图谱中亦未发现特异峰m/z 11 109，查阅文献发现本地区产KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌blaKPC主要位于IncFⅡ或IncX质粒上的Tn1721和Tn3转座子内[7]。因此我们推测，对于遗传背景不同的菌株，其特异峰也不尽相同。在本研究中，我们纳入了复旦大学附属华山医院和上海交通大学附属儿童医院的菌株，试验结果表明，利用特异峰m/z 4 521存在与否来鉴别菌株是否为ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的方法在上海地区可能具有普遍适用性。该方法具有快速、简便、经济和适用性强等优点，因此在区域流行病学研究中有良好的应用前景。

综上所述，本研究利用MALDI-TOF MS筛选出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的特异峰m/z 4 521，并且验证了该特异峰具有良好的临床应用前景。该特异峰可快速、准确地检测ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌，对此类临床常见型别肺炎克雷伯菌的用药指导和流行病学研究有重要的意义。

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