ZEB1在胃肠道间质瘤中的表达及其临床意义

杨盛兰，闵江

（1重庆医科大学附属第一医院心内科；2重庆医科大学附属第一医院胃肠外科，重庆 400016）

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）是消化道最常见的间叶来源的肿瘤，约占消化道肿瘤的1%-3%[1]。GIST几乎发生于胃肠道的任何部位，其中约60%发生于胃，约30%发生于小肠，约5%发生于十二指肠，约4%发生于直肠，约1%发生于食管，约2%发生于结肠及阑尾[2]。和其他上皮肿瘤不同，肿瘤大小和核分裂像是评价GIST危险度的两个最重要的病理特征，然而上述两个因素仍无法完整的预测GIST的恶性潜能[3-4]。

GIST被认为起源于Cajal 细胞同源的叶间干细胞，约95%的GIST表达KIT（CD117）[5]。络氨酸激酶是促进GIST发生和发展的重要信号通路，KIT是该信号通路的“开关蛋白”。约80%的GIST有KIT基因的突变，另外，5%～10%的GIST有PDGFRA的突变，二者均可导致络氨酸激酶信号途径的持续性活化，因此突变的KIT和PDGFRA是GIST诊断的重要依据，也是GIST治疗的重要靶点，与病人的预后相关[6-9]。同时，还有一些研究发现CDKN2A和p53这两个肿瘤抑制基因的失活突变与GIST的恶性病理特征呈负相关[10-13]。此外，抑癌蛋白dystrophins的失活与GIST的发生和转移有重要的相关性[14-16]。然而，能有效预测GIST恶性潜能和预后的分子仍较少。E盒锌指结合蛋白1（zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1）是锌指蛋白相关转录因子家族成员之一，可参与结直肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等多种上皮来源肿瘤转移[17-19]，但在间质来源细胞肿瘤中的作用还不完全清楚。我们前期小样本初染中发现，在不同GIST组织标本中，ZEB1的表达存在差异，但这种差异性表达的规律以及临床意义还不清楚。本研究通过选取较大样本的GIST临床石蜡标本，通过免疫组织化学方法检测GIST中ZEB1表达，分析其与GIST的临床病理学特征的关系，探寻ZEB1与GIST患者预后的关系。

材料与方法

1 标本来源

收集97例自2011年以来在重庆医科大学附属第一医院胃肠外科行手术治疗的胃肠间质瘤病人的术后病理标本的石蜡切片，并随访病理信息及患者术后状况。该研究符合重庆医科大学附属第一医院医学伦理委员会所制定的伦理学标准并通过该委员会批准，所有受试对象术前均签署知情同意书。所有病员术前未行伊马替尼治疗，均为单发可切除的间质瘤患者。所有肿瘤切缘术后均证实为阴性。所有标本术后均经过常规病理分析及c-KIT基因突变检测最终证实为间质瘤。采用2013版中国胃肠道间质瘤病理诊断治疗共识推荐的NIH2008年改良版对肿瘤的危险度进行分级。

2 免疫组织化学染色

将准备好的石蜡组织切片（5µm）置于60℃温箱中约1h后二甲苯 I、II各10min脱蜡；100%、95%、80%、70%酒精各2min，蒸馏水洗5min×2次（于摇床上）；3%H2O2室温10min，封闭内源性过氧化物酶；抗原修复：枸橼酸钠缓冲液（10mmol/L，pH6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3min后缓慢冷却；PBS洗5min×2后加山羊血清室温封闭30min；滴加鼠抗人ZEB1抗体（1∶200；Sigma），4℃过夜；PBS洗5min×2后滴加Envision二抗（GeneTech），37℃孵育30min；PBS洗5min×2后DAB显色约1min；去离子水终止显色，苏木素复染20s，盐酸酒精分化5s；自来水冲洗15min返蓝；梯度酒精脱水：依次80%和95%酒精各1min，100%酒精2min；二甲苯 I、II各10min透明；中性树脂封片。以已知强阳性染色的组织切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

3 结果判定

所有样本随机对照，每个视野计数100个细胞。染色强度分级计分标准： 0分（无染色）、1分（淡黄色）、2分（黄色或深黄色）、3分（褐色或棕褐色）。阳性细胞计分标准为： 0分（≤5%）、1分（5%～25%）、2分（25%～50%）、3分（50%～75%），4分（＞75%）。两者计分的乘积作为判断标准，0～4分为低表达，4～12 分为高表达。

4 统计学分析

所有统计分析使用软件SPSS16.0，卡方检验用于评估ZEB1表达与临床病理因素的相关性。利用Kaplan-Meier法对患者进行疾病无进展生存时间分析。P＜0.05为有统计学差异。

结 果

1 ZEB1在GIST中存在差异性的表达

对97例GIST的石蜡切片进行免疫组织化学染色发现，ZEB1均表达在细胞核内，且表达量存在明显的差异，其中43例为高表达，而剩余54例为低表达（图1）。

图1 ZEB1在GIST内的差异性表达。A，高表达病例；B，低表达病例；比例尺，25µmFig.1 Differential expression of ZEB1 in GIST stained by IHC.A, high expression; B, low expression; scale bar, 25µm

2 GIST中ZEB1的表达水平与临床病理因素的关系

对ZEB1的表达强弱与GIST的病理特征以及危险度进行相关分析显示，ZEB1的高表达与较多的核分裂像呈正相关（P=0.032）；较高的ZEB1表达提示更高的危险度（P=0.007）；ZEB1的表达与患者的年龄、性别，肿瘤发生部位及肿瘤大小无相关性（表1）。进一步分析ZEB1的表达与术后患者的疾病无进展生存时间的关系发现：ZEB1表达越高的患者其无进展生存时间就越短（P＜0.01)（图2）。

表1 ZEB1表达水平与GIST的临床病理因素的关系Tab.1 Relationship between ZEB1 expression level and clinicopathologic features of GIST

图2 ZEB1表达水平与GIST术后疾病无进展生存时间相关。ZEB1高表达患者的无进展生存时间远低于ZEB1低表达者Fig.2 The positive correlation between ZEB1 expression and prognosis of GISTs.The progression-free survival time in patients with high ZEB1 expression was significantly shorter than that of patients with low expression

讨 论

对于大多数的GIST患者，尽管基于手术和靶向药物伊马替尼的联合治疗已大大提高了其生存的时间，但仍有许多患者死于肿瘤的局部复发和难以控制的远处转移。以往的研究证实，ZEB1是调节上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）的重要分子，而上皮间质转换在肿瘤的复发转移中均有重要的作用。ZEB1作为转录抑制因子，一方面可直接抑制细胞黏附分子E-Cadherin的表达[20]，另一方面通过抑制某些促进上皮分化的分子的表达，如miR-183、miR-203和 miR-200家族等[21]，最终促进侵袭转移的发生。此外，ZEB1调节的上皮间质转换可使肿瘤细胞获得“干细胞特性”从而更容易复发[22]。因此，ZEB1被认为是上皮肿瘤进展和较差预后的预测因子。本研究通过免疫组织化学染色证实：ZEB1在间质细胞中也存在类似于上皮细胞的作用，高表达ZEB1的患者有更短的无进展生存时间，由此表明，无论在上皮细胞还是GIST中，ZEB1均能预测患者的预后。

核分裂像和肿瘤大小是GIST重要的病理特征，直接决定着GIST的危险度及发生转移的几率。我们的研究还发现ZEB1的表达与核分裂像呈正相关。核分裂像反应肿瘤当前的分裂状况，它与肿瘤的增殖相关，因此ZEB1可能参与了GIST肿瘤细胞周期的调节。然而，ZEB1和肿瘤的大小无相关性，可能存在其他机制拮抗ZEB1的生长效应。

由此可见，ZEB1可有效的预测GIST患者的预后，而ZEB1在GIST中的作用机制仍有待于进一步研究。

[1]Hirota S, Isozaki K, Moriyama Y, et al.Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors.Science, 1998, 279(5350)∶ 577-580.

[2]Miettinen M, Lasota J.Gastrointestinal stromal tumors∶ pathology and prognosis at different sites.Semin Diagn Pathol,2006, 23(2)∶ 70-83.

[3]Siegel RL, Miller KD, Jemal A.Cancer Statistics, 2017.CA Cancer J Clin, 2017, 67(1)∶ 7-30.

[4]D’Amato G, Steinert DM, McAuliffe JC, et al.Update on the biology and therapy of gastrointestinal stromal tumors.Cancer Control, 2005, 12(1)∶ 44-56.

[5]Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, et al.Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT) gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal.Am J Pathol, 1998, 152(5)∶ 1259-1269.

[6]Singer S, Rubin BP, Lux ML, et al.Prognostic value of KIT mutation type, mitotic activity, and histologic subtype in gastrointestinal stromal tumors.J Clin Oncol, 2002, 20(18)∶3898-3905.

[7]Lasota J, Jasinski M, Sarlomo-Rikala M, et al.Mutations in exon 11 of c-kit occur preferentially in malignant versus benign gastrointestinal stromal tumors and do not occur in leiomyomas or leiomyosarcomas.Am J Pathol, 1999,154(1)∶ 53-60.

[8]Beghini A, Tibiletti MG, Roversi G, et al.Germline mutation in the juxtamembrane domain of the kit gene in a family with gastrointestinal stromal tumors and urticaria pigmentosa.Cancer, 2001, 92(3)∶ 657-662.

[9]Roskoski R, Jr.Structure and regulation of Kit protein-tyrosine kinase—the stem cell factor receptor.Biochem Biophys Res Commun, 2005, 338(3)∶ 1307-1315.

[10]Schneider-Stock R, Boltze C, Lasota J, et al.High prognostic value of p16INK4 alterations in gastrointestinal stromal tumors.J Clin Oncol, 2003, 21(9)∶ 1688-1697.

[11]Ricci R, Arena V, Castri F, et al.Role of p16/INK4a in gastrointestinal stromal tumor progression.Am J Clin Pathol,2004, 122(1)∶ 35-43.

[12]Feakins RM.The expression of p53 and bcl-2 in gastrointestinal stromal tumours is associated with anatomical site,and p53 expression is associated with grade and clinical outcome.Histopathology, 2005, 46(3)∶ 270-279.

[13]Henze J, Muhlenberg T, Simon S, et al.p53 modulation as a therapeutic strategy in gastrointestinal stromal tumors.PLoS One, 2012, 7(5)∶ e37776.

[14]Wang Y, Marino-Enriquez A, Bennett RR, et al.Dystrophin is a tumor suppressor in human cancers with myogenic programs.Nat Genet, 2014, 46(6)∶ 601-606.

[15]Adamo CM, Dai DF, Percival JM, et al.Sildenafil reverses cardiac dysfunction in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(44)∶ 19079-19083.

[16]Wang Y, Fletcher JA.Cell cycle and dystrophin dysregulation in GIST.Cell Cycle, 2015, 14(17)∶2713-2714.

[17]Peña C, García JM, Silva J, et al.E-cadherin and vitamin D receptor regulation by SNAIL and ZEB1 in colon cancer∶clinicopathological correlations.Hum Mol Genet, 2005,14(22)∶ 3361-70.

[18]Peña C, García JM, García V, et al.The expression levels of the transcriptional regulators p300 and CtBP modulate the correlations between SNAIL, ZEB1, E-cadherin and vitamin D receptor in human colon carcinomas.Int J Cancer,2006, 119(9)∶ 2098-104.

[19]Dohadwala M, Yang SC, Luo J, et al.Cyclooxygenase-2-dependent regulation of E-cadherin∶ prostaglandin E(2) induces transcriptional repressors ZEB1 and snail in non-small cell lung cancer.Cancer Res, 2006, 66(10)∶ 5338-45.

[20]Eger A, Aigner K, Sonderegger S, et al.DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.Oncogene, 2005, 24(14)∶2375-85.

[21]Wellner U, Schubert J, Burk UC, et al.The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemness-inhibiting microRNAs.Nat Cell Biol, 2009, 11(12)∶ 1487-1495.

[22]Burk U, Schubert J, Wellner U, et al.A reciprocal repression between ZEB1 and members of the miR-200 family promotes EMT and invasion in cancer cells.EMBO Rep, 2008,9(6)∶ 582–589.