普通油茶花粉的超低温保存研究

（中国林科院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400 ）

油茶Camellia oleifera是山茶科Theaceae山茶属Camellia常绿灌木或小乔木，是我国特有的木本油料树种[1]。油茶籽榨出的茶油是一种高档的食用油，有“东方橄榄油”和“油中软黄金”的美誉，我国是世界上最大的茶油生产国。近年来，本课题组对油茶作了大量的基础研究工作[2-3]，陆续有研究表明普通油茶大多表现自交不亲和[4-5]，生产上需要配植授粉树或采用人工授粉提高坐果率[6-7]。另外，种间杂交育种工作中，油茶花期不遇给育种工作者带来很大困难。因此，研究油茶花粉保存对于促进油茶产业的进一步发展意义重大。

植物花粉是种重要的种质资源, 含有物种的全部遗传信息, 具有丰富的遗传多样性, 为种质交换和保存提供重要材料。近年来，油茶花粉性状及授粉特性的研究报道广泛[8-9]。油茶花粉在自然的条件下寿命短，低温冷藏可以适当延长寿命，但仍然不能满足杂交育种的需要。超低温保存是指将植物活体材料采用一定的技术措施，存入液氮中保存，需要时采用一定的方法使之回到常温并且能正常生长的一套生物技术措施[10]。超低温技术大大延长了花粉寿命，上世纪初，就有研究指出经-180 ℃保存的金鱼草花粉仍有活力，同时还发现，降低花粉的含水量能提高保存效果[11]。近年来，超低温技术陆续实现了农作物、果树、蔬菜、园林植物等多种花粉的有效保存[12-18]，但普通油茶花粉超低温保存研究一直未见报道。本试验以普通油茶3个品种无性系花粉作为试材，进行超低温保存研究，探讨油茶花粉超低温保存前的干燥脱水、预冻处理、从液氮取出后的解冻复苏方式对超低温保存效果的影响，为实现普通油茶花粉长期保存提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 花粉采集及处理

花粉采集于2014年10月中旬（盛花期）在浙江省金华市琅琊镇东方红国有林场油茶收集圃进行。该收集圃于2006年春营造，圃内油茶无性系树体健壮，长势良好，2008年正常开花结实。于晴天上午分别采集普通油茶无性系品种001、002、003号大蕾各500个以上放入自封袋，迅速带回实验室。用清洁的镊子从花蕾中取出花药后平铺到硫酸纸上，置于室温灯光下。花药开裂散粉后，用50目标准检验筛过筛，收集花粉。每个无性系的花粉分装3部分，一部分用1.5 mL离心管分装，测定含水量及萌发率；一部分进行干燥脱水处理并投放液氮，研究不同含水量的花粉超低温保存效果；另一部分用硫酸纸包好放入10 mL指形管中，并将指形管放入硅胶干燥器里置于4 ℃冰箱中，观测花粉低温冷藏保存效果。

1.2 方 法

1.2.1 花粉活力测定

花粉萌发率测定采用离体萌发法[19]，培养基采用 0.01% 硼酸 +0.03% 硝酸钙 +0.02% 硫酸镁 +0.01%硝酸钾 +15%蔗糖+1%琼脂[20]，培养温度为25 ℃。新鲜花粉培养4 h（预实验得出），超低温保存后的花粉培养8 h（预实验得出），分别镜检，统计萌发率。花粉萌发以花粉管长度超过花粉粒直径作为发芽标准。每个处理设置3个重复，每个重复观察4个视野，每个视野统计花粉粒不少于50粒，取12个视野萌发率的均值作为该处理下花粉的萌发率，以花粉萌发率作为花粉生活力指标。

萌发率＝观察视野内发芽花粉粒数／视野内花粉粒总数 ×100%

相对保持率＝（液氮保存后花粉萌发率／液氮保存前花粉萌发率）×100%

1.2.2 预冻及解冻处理

预冻：将花粉脱水干燥后分别置于-26 ℃预冻1 h、4℃预冻1h、4℃（1 h）→-20℃（1 h）→-80℃（1 h）变温预冻、以及室温条件下不预冻，然后投入液氮保存，30 d后测定萌发率。

解冻：将花粉从液氮中取出，分别置于室温（11 ℃）解冻（30 min）、38 ℃温水浴快速解冻（3 min）、4 ℃恒温解冻（30 min）以及-80 ℃（1 h）→ -20 ℃（1 h）→ 4 ℃（1 h）逐级升温进行复苏，40 d后测定萌发率。

1.2.3 花粉脱水及含水量测定

将花粉放入30℃的人工气候箱内进行干燥脱水处理，获得不同含水量的花粉。花粉含水量测定采用烘干法[18]，烘干温度为120 ℃，每次烘1 h，反复 5～8次，直至恒质量，每个处理设置3个重复。花粉含水量＝（花粉鲜质量－花粉干质量）／花粉鲜质量 ×100%。

2 结果与分析

2.1 低温（4℃）干燥保存油茶花粉寿命

将收集到的新鲜花粉用硫酸纸包好，放入硅胶干燥器中，再将盛有硅胶的干燥器置于4 ℃冰箱，定期测定花粉萌发率（见图1）。3种花粉活力变化趋势基本一致，随着保存时间的延长，花粉活力迅速降低。新鲜花粉含水量较高，保存10 d后，活力均有大幅度降低，保存30 d后花粉活力有所回升，此时花粉萌发率均维持40%以上；保存至90 d时，花粉发白，活力均低于30%，此后花粉萌发率更低；保存一年时间，活力完全丧失。据此，为保证杂交育种花粉质量，建议短期内可选择低温干燥保存花粉，但保存期限不宜超过一个月。

图1 油茶花粉在4 ℃干燥条件下活力变化Fig.1 Pollen germination rate under 4 ℃ condition

2.2 含水量对花粉保存的影响

大量研究表明，超低温保存前的适度脱水处理是保持花粉活力的关键。据表1，脱水干燥处理对普通油茶无性系3个品种花粉的超低温保存有类似影响。未脱水的花粉含水量均超过30%，超低温保存后，活力很低。经脱水处理，花粉含水量不断降低，花粉活力也不断下降，液氮保存后的花粉萌发率均呈现先升后降的趋势。001号花粉干燥脱水3～4 h，含水量为13.91%～14.43%时，超低温保存后活力最高；002号花粉脱水2～5 h至含水量为11.65%～14.29%时，液氮保存后活力最高达41.01%～44.09%；003号脱水3～5 h，花粉含水量为14.46%～15.70%时，超低温保存效果最好。因此，投放液氮前花粉的脱水处理对于保持其活力至关重要。

表1 含水量对油茶花粉超低温保存效果的影响Table 1 Effect of water content on germination rate of frozen Camellia pollen

2.3 预冻对花粉保存的影响

花粉脱水后分别经-26℃预冻1 h、4℃预冻1 h、4℃（1 h）→ -20 ℃（1 h）→ -80 ℃（1 h）逐级降温预冻、以及室温（11 ℃）不预冻等4种处理，投放液氮中保存30 d，在38 ℃水浴（3 min）解冻后，花粉萌发率见表2。-26 ℃预冻（1 h）处理过的3个油茶品种花粉萌发率均显著高于其他处理（P＜0.05）；逐级降温预冻效果次之；室温不预冻处理下花粉超低温保存效果最差。因此，-26 ℃（1 h）预冻处理对于3个油茶无性系品种花粉超低温保存最有效。

表2 预冻方式对油茶花粉超低温保存效果的影响Table 2 Effect of pre-freezing on pollen germination rate after LN2 storage %

2.4 解冻对花粉保存的影响

以液氮保存40 d的3个油茶无性系品种花粉作为试验材料，研究解冻方式对超低温保存效果的影响（表3）。表3可知，解冻方式对3个品种花粉超低温保存效果的影响较为一致。经38 ℃温水浴快速解冻（3 min），超低温保存的3种花粉萌发率均最高。-80 ℃（1 h）→ -20 ℃（1 h）→4 ℃（1 h）逐步升温解冻，对于001号花粉保存效果不及水浴解冻处理，对002、003号花粉超低温保存效果较好。逐级升温解冻处理下，002、003号花粉萌发率与水浴解冻处理差异不显著，但显著高于另外两个解冻处理。3种花粉在4 ℃缓慢解冻下，萌发率均最低。综上所述，38 ℃温水浴快速解冻（3 min）对于油茶花粉超低温保存效果最好。

2.5 超低温保存不同时间花粉活力变化

对液氮保存半年、一年时间的3个品种油茶花粉进行离体萌发试验，分别测定发芽率（表4）。据表4可知，3种花粉超低温保存总体效果较好。其中，002、003号花粉经超低温保存半年、一年时间，花粉仍保持很高活力，与贮藏前花粉活力差异不显著（P＞0.05），003号花粉超低温保存一年后活力较保存前有所提高；001号超低温保存后较初始花粉活力有显著降低（P＜0.05），这可能与花粉含水率较高有关，但保存时间对其萌发率也没有显著影响。3个品种油茶花粉在低温干燥条件下短期内保存效果较好，3个月后发芽率均低于30%，1年后活力全部丧失。因此，低温干燥仍难以满足杂交育种工作的需要。超低温保存大大延长了花粉寿命，超低温保存1年，油茶花粉仍保持90%以上的活力。由此可知，超低温技术能较好地应用于普通油茶花粉的周年保存。

表3 解冻方式对油茶花粉超低温保存效果的影响Table 3 Effect of different thawing methods on pollen germination rate after LN2 storage

表4 超低温保存一年油茶花粉活力变化Table 4 Pollen viability under cryopreservation after one year %

3 结论与讨论

山茶属花粉超低温保存已有成功报道[18-19]，本研究以普通油茶3个无性系品种花粉作为试验材料，旨在扩大油茶种质资源超低温保存及应用范围，解决油茶育种中花期不遇的困难。试验表明，花粉含水量是影响其超低温保存效果的关键因素，花粉投放液氮前的脱水处理至关重要。3个品种花粉经过30 ℃烘箱，干燥脱水2～5 h，花粉含水量达11.65%～15.70%时，超低温保存效果最佳。超低温保存前的预冻处理、花粉从液氮中取出后的解冻复苏处理对花粉活力都有显著影响。-26 ℃预冻（1 h）显现出很好的预冻效果，这与本课题组对山茶属花药超低温保存研究结果一致[19]；4 ℃预冻（1 h）及不预冻，花粉超低温保存后活力大大降低，这与花粉体内自由水含量过多、花粉细胞内结冰、造成的细胞破裂有关[22]。解冻处理中，38 ℃（3 min）水浴快速解冻效果最好，逐级解冻次之，这与前人的研究结果类似。另外，低温干燥保存油茶花粉，短期内保存效果较好，可以满足30 d内花粉保存的需要，随着保存时间的延长，花粉活力下降迅速，不能满足种质资源保存及长期杂交育种工作的需要。超低温技术能实现普通油茶花粉的周年保存，3种花粉经超低温保存一年仍保持90%以上的活力。

本试验中，003号油茶花粉在超低温保存一年后出现花粉萌发率较保存前略有升高的“冷刺激”现象。张玉进[12]对魔芋 Amorphophallus konjac “Wanyuan” 花 粉 、Van Der Walt[23]对 山龙眼属 Helicia花粉以及李秉玲[24]对芍药Paeonia lactif l ora 花粉超低温保存研究过程中都发现了这种“冷刺激”现象。张亚利[25]在梅花 Prunus mume花粉的超低温保存中也发现了类似现象，并探讨了花粉细胞钙离子的浓度变化，但该现象的机理目前尚不清楚，有待进一步研究。

[1]庄瑞林,周启仁,姚小华.中国油茶[M].北京:中国林业出版社,2008.

[2]林 萍,姚小华,滕建华,等.油茶杂交子代幼林生长性状的遗传分析 [J].经济林研究 , 2016, 34(1):6-11.

[3]曹永庆,姚小华,滕建华,等.施肥对油茶春梢生长及叶片矿质元素含量的影响 [J].经济林研究 , 2017, 35(2):166 -170.

[4]常维霞,姚小华.油茶无性系自交亲和性分析[J].林业科学研究,2016,29(4)：508-514.

[5]高 超,袁德义,杨 亚,等.油茶自交不亲和性的解剖特征[J].林业科学,2015,51(2):60-68.

[6]查钱慧,谭 莎,黄永芳,等 .5 个油茶无性系花粉贮藏特性及杂交亲和力的研究 [J].中南林业科技大学学报, 2015,35(10): 79-82, 108.

[7]刘慧敏,敖书飞,乌云塔娜 .‘湘林’系列油茶授粉品种配置模式研究 [J].中南林业科技大学学报,2016, 36(4): 17-24.

[8]朱 雯,李文锋,许逸林,等 .广宁红花油茶花粉性状及授粉特征 [J].中南林业科技大学学报,2016, 36(9): 51-56.

[9]王湘南,陈永忠,王 瑞,等 .不同种源油茶良种花粉生活力研究 [J].中南林业科技大学学报,2016, 36(12): 1-5.

[10]简令成.植物抗寒机理研究新进展[J].植物学通报, 1992,9(3): 17-22.

[11]赵树仁,武丽英.番茄花粉超低温保存研究[J].园艺学报,1993, 20(1): 66-67.

[12]张玉进,张兴国, 刘佩英.魔芋花粉的低温和超低温保存[J].园艺学报, 2000, 27(2): 139-140.

[13]Danielio, Ngnq, Tayoto, et al.Wet-cold preservation of west African yam(Dioscorea spp.) pollen[J].Journal of Agricultural Science, 2002, 138: 57-62.

[14]Honda K, Watanabe H, Tsutsui K.Cryopreservation of Delphinium pollen at -30 ℃[J].Euphytica, 2002, 126: 315-320.

[15]Parton E, Vervaeke I, Delen R, et al.Viability and storage of bromeliad pollen[J].Euphytica, 2002, 125: 155-161.

[16]张亚利,尚晓倩,刘 燕.花粉超低温保存研究进展[J].北京林业大学学报,2006,28(4):139-147.

[17]李广清.山茶花粉超低温保存研究[D].北京: 北京林业大学,2005.

[18]常维霞,姚小华,龙 伟.山茶属3种植物花药超低温保存研究[J].中国油料作物学报,2016,38(1):52-57.

[19]胡适宜.植物胚胎试验方法（一）花粉生活力的测定[J].植物学通报,1993,10(2):60-62.

[20]黄永芳,吴雪辉,何美儿,等.3种油茶植物花粉贮藏及生活里的研究[J].福建林学院学报,2011,31(1):56-59.

[21]殷晓辉,舒理慧.植物种质资源的超低温保存研究进展[J].热带亚热带植物学报,1996,4(3):75-82.

[22]Sparks D, Yates I E.Pecan pollen stored over a decade retains viability[J].Hort Science, 2002, 37(1): 176-177.

[23]Vander Walt I D, Littlejohn G M .Storage and viability testing of protea pollen[J].J Amer Soc Hort Sci, 1996, 121(5): 804-809.

[24]李秉玲,尚晓倩,刘 燕.芍药花粉超低温保存4年后的生活力检测[J].北京林业大学学报,2008,30(6):145-147.

[25]张亚利.梅花花粉超低温保存研究及花粉库的建立[D].北京:北京林业大学, 2007.