针灸辅助造影剂对小鼠大脑光声对比度的增强作用

吴 丹，蒋华北,2*

(1.电子科技大学电子科学与工程学院， 四川 成都 610054； 2.南佛罗里达大学医学工程系， 美国 佛罗里达州 33620)

0 引言

光声层析成像技术(photoacoustic tomography，pAT)这种无损成像模式最近十几年一直迅速发展，其以信息检测为依据，是一种根据生物组织内部的光学吸收差异，通过探测超声信号来获取光声信息的生物医学光子成像方法，这种结构与功能医学成像技术非常具有发展前景[1-5]。pAT技术可借助外源造影剂来增加被测物体与周围背景组织间的成像对比度，也可提高成像深度以及成像分辨率，同时外源造影剂可以增强系统的检测灵敏度，帮助定位识别特定的组织[6-10]。

贵金属纳米颗粒现已被广泛用作光声成像造影剂，其由于表面等离子体共振效应，对于特定的光有很强的吸收。贵金属纳米颗粒不但具有优越的光学特性，且具有成熟的制备工艺和优异的表面结合特性，在光学与生物医学领域应用很广[11-13]。贵金属纳米粒子的线性光学特性(消光，吸收与散射)受粒子尺寸、形状、材料及周围介质介电特性等因素的强烈影响[11,13]。一般的贵金属纳米颗粒对光的吸收比传统的染色分子对光的吸收要大几个数量级[13]。此外，贵金属纳米颗粒表面还可以进行聚乙二醇(pEG)修饰，这样可以增强其在体内的循环时间，减少其细胞毒性，并且可以是纳米颗粒更加稳定，减少其聚合[11,13]。目前有很多贵金属纳米颗粒作为光声成像造影剂，主要有两种材料，金和银。金纳米球型颗粒(Au nanoparticles)的吸收峰一般集中在520-550 nm可见光谱范围内，其直径在20-80 nm范围内变化，其吸收波长颗粒直径的增加而增加[13]，它很适合被用于做光声活体实验。

针灸中针法是指在传统中医理论的指导下把针具(通常指毫针)按照一定的角度刺入患者体内，运用捻转与提插等针刺手法来对其特定部位(穴位)进行刺激从而达到治疗疾病的目的。穴位，学名腧穴，指人体经络线上特殊的点区部位[14,15]。大量研究表明，针灸穴位对人和动物的调节作用，与刺激神经系统的作用和调节作用密切相关。针刺可以对周围神经系统包括脑干，下丘脑，基底节和大脑皮层产生不同的影响[14]。我们之前的光声成像研究表明，针刺涌泉穴(KI01)和阳陵泉穴(GB34)可以无创地增加活体小鼠大脑皮层血流动力学参数[脑血流(cerebral blood flow，CBF)、血红蛋白(total hemoglobin，HbT)浓度][16,17]。

在这项研究中，我们发展了一种基于针灸辅助造影剂的方法。此方法中，静脉注射pEG-Au纳米颗粒溶液作为成像造影剂，同时通过结合针刺小鼠阳陵泉穴位(GB34)来增加小鼠大脑皮层血红蛋白浓度的方式，共同提高小鼠大脑皮层脉管系统的光声响应，提高大脑皮层血管与周围背景组织间的成像对比度与成像分辨率。据我们了解，这是第一次同时利用上述两种外源辅助方法来对小鼠大脑皮层脉管系统进行清晰地高对比度的光声层析成像。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究中使用22只体重在27 g至35 g之间的雄性健康无特定病原体动物(specific pathogen free，SpF)癌症研究所(institute of cancer research，ICR)小鼠。所有动物实验都得到了学校动物伦理委员会的批准。所有的小鼠在实验过程中均利用浓度为10%的水合氯醛溶液施加麻醉，腹腔注射给药剂量为4 mL/kg体重。利用一个恒温系统来帮助维持小鼠体温在(37±1)℃，这对于实验过程中降低小鼠死亡率是至关重要的。成像前，利用电推剪去除鼠头部和右后肢的毛发，然后用脱毛膏进行二次备皮。根据需要，位于右后肢的阳陵泉穴位用轻微的标记点标记。在成像期间，将小鼠放置在自制固定架子中，其头部，尾部和四肢被限制活动，在小鼠头上涂抹超声波耦合剂。

1.2 实验仪器

本项研究工作，主要使用自主搭建的环形扫描pAT系统进行实验研究(见图1)。在使用532 nm脉冲Nd-YAG激光器(Brilliant b，Quantel)作为激发光源，脉冲持续时间为6-9 ns，最大脉冲功率为400 mJ，脉冲重复频率为1.25 Hz。在这项工作中，动物头皮表面的脉冲光功率为10 mJ/cm2，在皮肤能承受的激光能量安全阈值之内。固定小鼠的自制架子放在一个高度可调的升降台上。激光出口下方放置一个水槽，底部中央有一个开口，利用用透明的聚乙烯薄膜密封。小鼠头皮与薄膜间接接触，为了最大化传输超声波，中间涂有超声耦合剂。激光束经由凹透镜扩束，然后经过毛玻璃均匀化。小鼠头部在出射光照射后吸收光能，并产生光声信号，利用一个放置在距离成像中心45 mm处的5 MHz中心频率超声换能器探测该光声信号。通过步进电机控制超声换能器进行旋转，超声换能器以成像目标为中心，2度为步长进行360度旋转，因此在一个成像实验中检测180个探测位置的信号，单幅图像采集时间大约2分24秒，最后利用延迟叠加重构算法通过光声信号重建出光声脑图像。

图1 活体小鼠光声层析成像系统结构图Fig.1 Schematic of the home-made pAT system for in vivo mouse brain imaging

1.3 造影剂：金纳米颗粒

在这项研究中，我们使用pEG-Au纳米颗粒作为活体大脑光声成像的造影剂。pEG-Au纳米颗粒由成都盛泰尔生物医药科技有限公司合成。金纳米颗粒的平均粒径为40 nm，pEG包裹厚度为5-10 nm。扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)图像显示，溶液中具有45-50 nm尺寸的pEG-Au纳米颗粒，参见图2(a)。图2(b)和2(c)分别描述了这种颗粒的吸收光谱和该溶液的实物照片。如吸收光谱所示，该纳米颗粒在532 nm附近显示出强烈的等离子体共振吸收峰。该溶液的浓度是1×1011Nps/mL或1.67×10-15mol/L(摩尔浓度)。图2(d)表明，光声信号幅度与pEG-Au纳米颗粒溶液浓度之间存在正相关关系。此外，图2(e)为装有该溶液的离心管的高光学对比度pAT图像。

1.4 针灸穴位选取

许多研究表明，针灸人或动物的特定穴位会引起功能性脑区的响应[18-25]。 阳陵泉穴(GB34)位于小鼠后肢的外侧，在腓骨头前下方的的凹陷处，皮下有股二头肌，膝下外侧动、静脉和腓浅及腓深神经分布。GB34是足少阳之脉所入为合的合上穴，为八会穴之筋会[26]。大量的研究表明，针刺阳陵泉穴位时，患有急性脑卒中、帕金森病等神经性脑疾病的病人或动物会有不同程度的疗效[27-31]。另外，本实验室以往及近期的研究表明，针刺阳陵泉穴可以产生脑血流动力学改变，有助于缓解血管闭塞，改善体内小鼠脑血流灌注不足的血液供应[16,17]。本研究选择位于小鼠右后肢的GB34作为刺激穴位(对比研究表明，针刺左侧穴位与右侧穴位之间无显着性差异[16,17])。我们迅速地将无菌不锈钢针(直径：0.25 mm；长度：25 mm)垂直插入阳陵泉穴位处的皮肤中，深度为3-4 mm。然后我们手动将针头以每分钟60-70下的恒定频率快速捻转。与之前的研究操作方法一致，在针灸后的两分半钟，留针超过30分钟。

a：pEG-Au纳米颗粒的SEM图； b：吸收光谱图；c：实物照片；d：光声信号幅度与溶液浓度之间的关系曲线；e：装有该溶液的离心管的光声图像。a: SEM image of the pEG-Au nanoparticles; b: Optical absorption spectrum; c: photograph of nanoparticle solution; d: Relationship between the solution concentration and relative pA signal amplitude; e: photoacoustic image of the tube containing solution.图2 金纳米颗粒的光学特性Fig.2 Optical properties of pEG-Au nanoparticles

1.5 实验操作

为了评估在金纳米粒子以及针灸阳陵泉穴位后小鼠大脑皮层脉管系统的光声响应程度。我们设计了3组pAT实验。各组小鼠进入麻醉状态后，先将针灸位置与成像位置脱毛，在GB34穴位处做好标记，固定后进行光声层析成像，整个准备过程大概需要20分钟。小鼠每5分钟进行一次pAT脑成像，所有小鼠都处在相同的实验环境中。在第一组对照组实验(Group I)中(Group I中使用6只小鼠，写作n=6)，我们将生理盐水注射到小鼠尾静脉中，在注射之前采集一幅图像，在注射之后采集另外7幅图像；第二组实验(Group II，n=8)中，针刺阳陵泉穴位前后共采集8幅图像；第三组实验(Group III，n = 8)中小鼠接受两轮外源刺激，第一轮中将pEG-Au Nps溶液连续两次注射到小鼠尾静脉中，每次注射剂量约为6.67×108Nps/g(体重)，并且在注射前后共采集8幅图像，之后同一批小鼠接受第二轮实验，对每只小鼠在阳陵泉穴处施加针灸刺激，再采集7幅图像，即Group III中每只小鼠从头到尾共采集15幅图像。在pAT实验结束后，通过注射过量的水合氯醛让小鼠安乐死。

1.6 统计分析

所有数值均以平均值±标准误差(SEM)表示。 统计分析采用非配对t检验的方法，统计学显著性定义为p≤ 0.05。

2 实验结果与讨论

2.1 对照组实验

在这项研究中，为了评估在没有外源刺激的实验中，大脑皮层脉管系统在正常生理条件下的真实变化，故而设计一个对照组(Group I)。本组实验中，每只小鼠都要接受尾静脉生理盐水注射。图3(a)中显示了Group I中的小鼠大脑皮层的一组光声图像，图像右侧的色标是经过归一化的结果，图3(b)表示Group I的时间轴。从图中可以看出，相比于尾静脉注射生理盐水前，注射后的图像中脑血管变得越来越不清晰，脑血管的光吸收以及成像对比度很明显随着整个时间轴呈下降趋势，这个结果也许是由于小鼠在pAT实验中，处于负压状态，负压对血流有一定抑制作用影响。当动物的身体被绑在支架上，头部被压迫在聚乙烯薄膜下面时，可能会造成脑部暂时性的供血不足[32]。

a：第一组实验中的活体小鼠光声脑图像；b：第一组实验时间轴a: In vivo photoacoustic images of a mouse brain from Group I; b: Experimental timeline for Group I图3 对照组(第一组)实验的光声图像Fig.3 photoacoustic images for the control group (Group I)

2.2 针灸组实验

图4(a)为针灸组(Groop II)中小鼠大脑皮层的八幅pAT图像，图4(b)表示Group II的时间轴。本组图像中，利用了图像相减的图像处理方法，将针灸后的每一个时刻相对于针灸前增加的相对像素值部分用紫色色标来表示，即图像中紫色代表脑血管光吸收或者光对比度增强的部分。与针刺前的图像相比，针刺小鼠阳陵泉穴后，皮层静脉血管能够更清晰地显像，皮层血管光学对比度得到增强。另外，在注射后15分钟时，光吸收增长量到达峰值水平，之后光吸收增长量有所减少，但并未低于初始状态，这可能是由于针刺效应在减弱。以上结果表明，针刺阳陵泉穴能促进CBF增强以及HbT浓度增加，这可能是由于血液供应增加和脑血管阻力降低所致血供改善，与之前本实验室的研究结论一致[16,17]，即针刺阳陵泉穴可激活一些大脑区域。然而，并不是所有的大脑区域在小鼠被针刺之后都具有增加的光学对比度。这表明针刺阳陵泉穴不会将小鼠皮层每一个脑区都激活。

2.3 造影剂组实验以及复合组实验

Groop III中小鼠接受两轮外源刺激，第一轮(造影剂组，Groop III-1st)中将金纳米颗粒溶液连续两次注射到小鼠尾静脉中，每次注射剂量约为6.67×108Nps/g(体重)，并且在注射前后共采集8幅图像如图5(a)。在注射纳米颗粒溶液后，大脑皮层血管与周围背景组织间的成像对比度明显大幅提高，与对照组的图像相比，这个组的皮层脉管系统显示的非常清晰。此外，注射纳米颗粒之后造影剂点亮了一些“隐藏的”静脉血管(由于其注射造影剂前对比度低而不可见)，图像中红色部分代表第一轮脑血管光吸收或者光对比度增强的部分。可以看出，注射后15分钟，光吸收增长量到达峰值水平。结果表明，造影剂可以有效地提高大脑皮层的对比度。在达到峰值后，由于脑血流很快会对纳米颗粒有一定地清除，光吸收增长量缓慢下降，直到35 min后图像采集结束时仍保持大于初始状态的光吸收水平。此外，并非所有的大脑皮层区域光学对比度都体现出增强，这表明造影剂不能渗透到大脑皮层的每一个区域。

之后同一批小鼠接受第二轮实验(复合组，Groop III-2nd)，对每只小鼠在阳陵泉穴处施加针灸刺激，这时纳米粒以及针刺阳陵泉穴同时作为外源刺激，再采集7幅图像(见图5(b))，即Group III中每只小鼠从头到尾共采集15幅图像。图5(c)表示Groop III两轮实验的时间轴。在右腿外侧针刺阳陵泉穴后，脑血管的对比度又出现第二轮的大幅提高，与第一轮的图像相比，这个轮的皮层脉管系统显示的更为清晰，图像中蓝色部分代表第二轮脑血管光吸收或者光对比度增强的部分。可以看出，在45 min处光吸收增长量到达第二个峰值，这是注射金纳米颗粒溶液结合针刺小鼠阳陵泉穴位共同作用引起的小鼠大脑皮层脉管系统的光声响应增强，Groop III验证了针灸辅助金纳米粒子的方法可以大大提高大脑皮层血管与周围背景组织间的成像对比度与成像分辨率。

a：第二组实验中活体小鼠光声脑图像；b：第二组实验时间轴a: In vivo photoacoustic images of a mouse brain from Group II; b: Experimental timeline for Group II图4 第二组实验的光声图像Fig.4 photoacoustic images for the acupuncture group (Group II)

a，b：Group III-1st组和Group III-2nd组实验中活体小鼠光声脑图像；c：第三组实验时间轴a, b: In vivo photoacoustic images of a mouse brain from Group III-1st and Group III-2nd, respectively; c: Experimental timeline for Group III图5 第三组实验的光声图像Fig.5 photoacoustic images for the acupuncture group (Group III)

2.4 统计结果

我们根据上述三组实验计算了的光声脑图像的相对光吸收变化率，对结果进行统计分析(具体参见图6(a))，计算结果反映皮层脉管系统对单一或者复合外源刺激的响应。统计结果显示，Group I的最大光吸收下降百分比为8.27%±6.05%(平均值±标准误差SEM)。另外，试验组(Group II，III)与对照组(Group I)之间有显著性统计学差异(p<0.01)。Group II中针灸GB34引起的最大光吸收增长百分比为23.87%±15.95%，Group III-1st中造影剂引起的最大光吸收增长百分比为38.56%±50.82%。然后Group III-2nd中在两者共同作用情况下，总的最大光吸收增长百分比为66.75%+70.87%，其最大增长率远高于Group II和Group III-1st，并且大于两者之和，由此可以推断针刺阳陵泉穴位可能在一定程度上增加小鼠脑内金纳米颗粒的传递。图6(b)列出了Group I，II，III-1st以及III-2nd中脑血管光学对比度每隔5 min随时间的变化情况。对于Group I，对比度先明显下降，后保持在稳定水平。对于Group II和Group III-1st，对小鼠施加单一外源刺激后，脑血管对比度均在第15 min处出现峰值，之后呈现出缓慢的下降震荡趋势。对于Group III-2nd，对小鼠施加两种外源刺激后，脑血管对比度在第10 min处出现统计学最大值，之后其变化呈现出缓慢的周期性震荡趋势。我们发现Group III-2nd组针刺引起的吸收统计峰值比Group II和Group III-1st早5 min。

a：三组实验中最大光吸收变化率的统计直方图；b：三组实验中随时间轴改变的归一化相对光吸收变化率的统计直方图a: Histograms of maximum optical contrast variation for three groups of mouse experiments; b: Histograms of optical contrast variation over time for three groups of mouse experiments图6 三组实验的相对光吸收变化率统计结果Fig.6 Histograms of normalized relative optical contrast variation in the mouse brain for three groups of experiments

3 总结

本文开发了一种有效的提高对比度和成像分辨率的方法，该方法集合了两个关键外源辅助方法，包括静脉注射金纳米颗粒溶液，以及针刺小鼠阳陵泉穴位(GB34)。利用自主搭建的pAT系统，我们成功地捕获了由针灸辅助造影剂在活体小鼠大脑皮层中诱导的光学对比度随时间的变化，证明了两者共同作用产生的皮层光吸收增强的复合效应远大于任何一种单独作用产生的效应。结论揭示了该复合方法有助于更好提高小鼠大脑皮层脉管系统的光声响应，提高大脑皮层血管与周围背景组织间的成像对比度，并且能够让皮层血管更清晰的显像。接下来，我们将利用靶向载药金纳米粒子应用于活体小鼠脑成像，这可能会进一步揭示针灸特定穴位与造影剂之间的相互作用机理，这将有助于研究促进造影剂以及药物传递和分布的新方法。

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