苹果中福美胂残留的RP-HPLC检测

牛鹏飞， 申 远， 李 帅, 郭玉蓉

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院， 陕西 西安 710062)

福美胂是一种二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂，化学名称为三-N-二甲基二硫代氨基甲酸胂。其抗菌性强并且具有持效期长,在树皮死组织部位渗透力强的特点，对多种农作物的多种病害均有防治效果，尤其对苹果腐烂病有较好的防治作用[1-2]，因此曾有过比较广泛的使用，尤其是在北方果树生产上有广泛应用[2]。福美胂为中等毒性，可通过呼吸道、胃肠道和皮肤吸收，排泄出体外的过程长，还会在体内转化成毒性可能更大的无机三价砷及其衍生物，产生无机砷中毒症状，对皮肤、粘膜亦有刺激作用，一旦发生福美胂中毒，其诊断、治疗均较困难[3]。由于在果园中使用福美胂，造成果树、环境甚至生态系统严重污染[4-5]，因此早在2007年以前，中国就已禁止砷制剂在果树生产中的使用[6]。但在2012年，有媒体报道，在中国某苹果主产区，一种无任何标志、小作坊式生产的药袋被部分果农使用，这种药袋内部涂布福美胂和退菌特，并包裹在幼果上直至其成熟,而对于苹果中是否确实存在福美胂和退菌特，国内多家检测机构都表示无法检测。中国作为世界上最大的水果、蔬菜生产国和主要的出口国[7],中国苹果的出口对全球苹果市场影响巨大[8]，“药袋”事件对中国苹果产业产生的国际负面影响不容忽视。福美胂作为“药袋事件”的元凶之一，理应受到严格的监管。但目前国际上福美胂的药物残留检测尚属空白，因此福美胂残留检测方法的建立，尤其是确定苹果中福美胂残留的检测方法成为保证苹果产业安全的首要任务。国际上，二硫代氨基甲酸酯类农药的检测方法有GC法[9]、GC-MS法[10]、HPLC-MS法[11-13]、酶联免疫吸附剂测定法[14]以及衍生化结合HPLC法[15]，但上述方法均未涉及福美胂的检测。在国内，二硫代氨基甲酸酯类农药的检测多采用测定CS2含量的间接方法，即检测二硫代氨基甲酸根酸性水解释放出的CS2量[16]。但因二硫代氨基甲酸酯类农药种类很多，酸性水解都会产生CS2，检测时无法区分CS2来源，因此无法定量检测福美胂[17]。而检测食品中总砷[18-19]、无机砷[18-21]和有机砷[22]的方法也都无法准确定量福美胂的残留量。目前，福美胂残留的定量检测仍是一个空白，国内外均无此类报道。本研究以此为切入点，拟建立苹果中福美胂残留的快速检测方法，解决苹果中福美胂无法定量检测的难题，以保障中国苹果产业健康发展。

1 材料与方法

1.1 材料

市售无公害鲜苹果

1.2 试剂

福美胂标准品(纯度≥99.0%)购自河北冠龙农化有限公司,乙腈(色谱纯)购自美国Fisher公司,三氟乙酸(分析纯)购自上海科丰化学试剂有限公司,苯(分析纯)购自天津天力化学试剂有限公司,试验用水为超纯水。

1.3 标准品储备液制备

准确称取福美胂标准品53.1 mg，乙腈溶解、定容至100 ml容量瓶,制成浓度为531 mg/L的福美胂标准储备液,置于冰箱中4 ℃备用。

1.4 仪器

高效液相色谱系统：P680型泵(在线脱气机，梯度混合器及20 μl定量环)和UVD 170U型紫外检测器，美国DIONEX公司产品；DiamonsilTM型二代C18色谱分析柱(250.0 mm×4.6 mm ID，5.0 μm),DIKMA有限公司产品；AT-330型柱温箱,天津奥特赛恩斯仪器有限公司产品；U-3010型紫外/可见分光光度计,日本HITACHI公司产品；DN-12A氮气吹干仪,天津市东康科技有限公司产品；FW400A高速万能粉碎机,北京科伟永兴仪器有限公司产品；SHZ-III型循环水真空泵,上海亚荣生化仪器厂产品；AL204型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。

1.5 色谱条件

流速：1.0 ml/min，进样体积：20 μl，检测波长：247 nm,柱温：30 ℃,流动相：以0.1%三氟乙酸水溶液为溶剂配制乙腈含量为10%溶液作为A相，100%乙腈为B相(A相∶B相=60∶40，体积比)。

1.6 样品的前处理

苹果去梗，保留整果，高速粉碎成果泥状。准确称取10.0 g苹果泥置于100 ml磨口三角烧瓶中，加入20 ml苯，剧烈震荡提取30 min，静止5 min，取上清萃取液，重复萃取4次，合并萃取上清液于100 ml容量瓶中，用乙腈定容,充分摇匀，取10 ml萃取液，氮气吹干，用2 ml乙腈复溶，过0.45μm有机滤膜，待分析。

1.7 标准溶液的色谱分离及检测系统稳定性的考察

采用方法1.5的色谱条件，对福美胂标准溶液进行分离和检测，同时对适当浓度的标准溶液连续进样3次，以峰系数(保留时间、峰值和峰面积)变异系数(CV)考察HPLC系统以及分析方法运行的日内稳定性。同时对保留时间的日间精密度(1 d进样2次，共进样3 d)进行分析，以CV评价色谱系统以及方法的日间稳定性。

1.8 标准曲线的建立

分别取福美胂标准品储备液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml于6只100 ml容量瓶中，乙腈定容，过0.45 μm微孔有机滤膜，按方法1.5的色谱条件进行测定，以峰面积对浓度进行线性回归。

1.9 检出限、定量限的测定

在同一批样品中添加不同浓度的福美胂标准品溶液，对样品进行处理，按方法1.5的色谱条件进行检测。

1.10 加标回收率的测定

在同一苹果样品中添加不同体积的福美胂标准品溶液，按方法1.6的方法进行处理，按方法1.5的色谱条件进行检测(重复5次)，以评价样品前处理对福美胂回收率的影响。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

以乙腈为空白溶液，对浓度为5.31 mg/L福美胂标准品储备溶液进行紫外全波长扫描(图1)，试验结果表明，福美胂的最大吸光度在247 nm处。

图1 福美胂标准溶液的紫外扫描光谱图Fig.1 Ultraviolet scanning spectra of standard solution of asomate

2.2 福美胂的分离

在相同的色谱条件下，对同一浓度的福美胂标准品溶液连续进样3次，记录保留时间、峰值以及峰面积值。如表1所示，福美胂保留时间、峰值以及峰面积的CV(n=3)均小于2%，其中保留时间的日精密度CV(n=3)为0.16%。由此可见，仪器和方法的稳定性均比较好。

表1 福美胂检测系统的稳定性

连续进样6次(1 d 2次，共3 d)，考察福美胂保留时间、峰值以及峰面积的日间精密度。如表2所示，福美胂保留时间、峰值和峰面积的日间精密度CV均小于1%，表明仪器和方法的日间精密度可以满足检测要求。

表2 福美胂检测方法的日间精密度

2.3 福美胂标准曲线

如图2所示，福美胂浓度与峰面积呈现良好的线性关系，Y=0.378 0x-0.123 2，R2=0.999 7，线性范围：5.31 mg/L至53.1 mg/L。其中，Y为福美胂的峰面积(mAU·min)；x为福美胂质量浓度(mg/L)。因此，用峰面积定量法对福美胂进行定量分析是可行的。

图2 福美胂标准曲线Fig.2 The standard curve of asomate

2.4 福美胂检测限

以S/N=3定为检出限(LOD)，以S/N=10定为定量限(LOQ)，测定苹果中福美胂的LOD为0.295 3 mg/kg，LOQ为1.206 7 mg/kg。

2.5 福美胂加标回收率

按方法1.10的方法，在苹果样品中加入适当体积的福美胂标准品溶液后进行色谱分析。如图3、图4和图5所示，福美胂得到了良好的分离与检测。

图3 福美胂标准溶液的色谱图Fig.3 The chromatogram of standard solution of asomate

图4 苹果空白样品色谱图Fig.4 The chromatogram of blank apple sample

图5 添加福美胂的苹果样品色谱图Fig.5 The chromatogram of apple sample with asomate

参考福美双和福美锌在水果中的残留限量[12]，在苹果样品中添加不同剂量的福美胂标准品，进行色谱分析，计算其加标回收率。如表3所示，福美胂的加标回收率为 76.56%～100.22%，变异系数(CV)为 4.86%～7.51%。因此，该色谱分析方法对于苹果中福美胂残留的分析是准确、可靠的。

3 结 论

本研究建立了定量检测苹果中福美胂残留的RP-HPLC方法。该方法在准确度、精密度以及回收率等方面均能满足国家对农药残留分析质量控制要求[23],可以用于苹果中福美胂残留检测。

表3 苹果样品中福美胂加标回收率(n=5)

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