JAK2-STAT3/STAT5 信号通路与儿童食物过敏CD4+T淋巴细胞亚群变化的相关性研究①

曾晓燕 胡 波 李传应 陈必全

(安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230001)

儿童食物过敏又称小儿消化系统变态反应、食物变态反应或过敏性胃肠炎，即因为食品或其添加剂诱发的IgE或非IgE免疫反应，从而导致小儿消化系统甚至全身变态反应发生，出现腹痛、患儿烦躁不安、甚至肠道出血等严重现象[1，2]。根据临床流行病学统计，小儿食物过敏的临床发病率高达8%，牛奶是导致其发病的最重要因素，且由于现代儿童喂养和饮食特点的改变，其临床发病率有进一步升高趋势[3]。因此，针对儿童食物过敏的发生和治疗的研究具有重要意义和价值。CD4+T细胞作为机体最重要的免疫细胞之一，可分化为多种亚型，参与包括免疫监视、排斥、杀伤等重要过程。而JAK2-STAT3/STAT5信号通路参与多种细胞生长调控及免疫反应发生。故本研究将首先观察比较儿童食物过敏患儿和正常儿童外周血CD4+T淋巴细胞亚群的百分比变化，进一步针对JAK2-STAT3/STAT5信号通路进行分析，探讨二者是否与过敏存在相关性及潜在调控作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料 根据如下纳入标准和排除标准收集2015年1月至2017年3月来我院就诊的儿童食物过敏患儿78例，为过敏组；同期收集来我院体检的健康儿童78例，为对照组。过敏组：男42例，女36例，并根据年龄分组，A组≤1岁(27例)，B组1～3岁(不包括1岁，22例)，C组3～6岁(不包括3岁，14例)，D组6～11岁(不包括6岁，15例)，体重5.65～32.71 kg，平均体重(13.7±4.9)kg。对照组：男41例，女37例，A组≤1岁(25例)，B组1～3岁(不包括1岁，22例)，C组3～6岁(不包括3岁，14例)，D组6～11岁(不包括6岁，17例)，体重5.69～32.75 kg，平均体重(13.9±4.6)kg。两组患儿年龄、性别、体重均无统计学差异。

纳入标准：①患儿均为牛奶所致过敏性小肠结肠炎，表现为皮肤、黏膜充血水肿，恶心、呕吐、间歇性腹泻等典型过敏表现，并经血生化检验，血清特异性IgE检测确诊IgE所致小儿食物过敏；②患儿和正常儿童及家属均签署知情同意协议，愿意配合研究。

排除标准：①患儿存在其他过敏性疾病，如过敏性紫癜、哮喘或血液系统疾病，可影响CD4+T淋巴细胞亚群的检测；②患儿存在慢性炎症疾病、先天性疾病或其他疾病可影响JAK2-STAT3/STAT5信号通路的表达和活化；③患儿基础条件较差，难以配合治疗研究。

1.2方法 抽取两组儿童外周静脉血10 ml，分装2管，各5 ml，分别用肝素和肝素锂抗凝。

肝素锂抗凝血用于流式细胞仪检测，取1.5 ml肝素锂抗凝血，常规分离获得单核细胞并重悬，调整细胞悬液浓度至106ml-1，分别加入CD3-ECD、CD4-PE、CD8-perCP、CD24-FITC并留置对照管，加入同型IgG-FITC，同时给予细胞内染色，加入抗IFN-γ、IL-4、IL-17等特异性抗体，随后经流式细胞仪检测各组患儿外周血CD分子和细胞因子是否表达，及具体百分比。其中CD4+IFN-γ+代表Th1细胞、CD4+IL-4+代表Th2细胞、CD4+CD25+代表Treg细胞、 IL-17+代表Th17细胞。

肝素抗凝血用于qPCR检测JAK2-STAT3/STAT5 mRNA表达水平，首先离心分离外周血单核细胞，采用Trizol(Life technology,USA)提取细胞总RNA，采用反转录试剂盒(TaKaRa，Japan)构建cDNA，并经SYBR GreenⅡ(TaKaRa，Japan)行定量PCR，检测JAK2、STAT3、STAT5的表达水平。引物序列如下：JAK2:F:5′-TCTGGGGAGTATGT-TGCAGAA-3′;R:5′-AGACATGGTTGGGTGGATACC-3′;STAT3:F:5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′;R:5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′;STAT5:F:5′-GCAGAGTCCGTGACAGAGG-3′;R:5′-CCACAGGT-AGGGACAGAGTCT-3′。

分析两组儿童上述CD4+T淋巴细胞亚群和JAK2、STAT3、STAT5表达水平的差异，采用Pearson相关性分析分析JAK2-STAT3/STAT5 信号通路和CD4+T淋巴细胞亚群的相关性。

1.3统计学处理 所有统计学分析均采用SPSS22.0软件。本研究计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验，两计量资料间相关性比较采用Pearson相关性分析，计算相关性系数r，若r>0，则两组间呈正相关性，反之负相关，且P<0.05，差异存在统计学意义。

2 结果

2.1CD4+T淋巴细胞亚群比较 根据表1可知，对照组A组、B组、C组儿童Th1、Treg淋巴细胞百分比及Th1/Th2、Treg/Th17比值均明显高于过敏组患儿A组、B组、C组，而Th2、Th17淋巴细胞百分比均小于过敏组所对应的同年龄段患儿，随儿童年龄增大，两组间差异均明显减小，但差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组D组儿童和过敏组D组儿童上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2JAK2、STAT3、STAT5 的mRNA表达水平比较 根据表2可知，对照组JAK2、STAT3、STAT5的mRNA表达水平均明显低于过敏组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴细胞亚群的相关性比较 由表3～6可知，针对JAK2和CD4+T淋巴细胞亚群水平进行相关性比较，A、B、C三组Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相关性系数均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相关性系数均>0(P<0.05)。针对STAT3和CD4+T淋巴细胞亚群水平进行相关性比较，Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相关性系数均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相关性系数均>0(P<0.05)。针对STAT5和CD4+T淋巴细胞亚群水平进行相关性比较，Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相关性系数均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相关性系数均>0(P<0.05)。且上述三组的相关系数绝对值逐次减小，提示随患儿年龄增大，相关性逐渐减弱，同时，针对D组进行相关性分析，上述信号通路分子与CD4+T淋巴细胞亚群水平均无明显相关性。

表1两组儿童CD4+T淋巴细胞亚群比较

Tab.1ComparisonofCD4+Tlymphocytesubsetsintwogroups

GroupsControl group A(n=25)Allergic group A(n=27)Control group B(n=22)Allergic group B(n=20)Control group C(n=14)Allergic group C(n=16)Control group D(n=17)Allergic group D(n=15)Th1(%)15.42±3.519.03±2.171)15.49±3.2913.56±2.221)15.97±3.2810.23±2.571)16.59±3.2713.21±3.05Th2(%)0.73±0.161.22±0.241)0.77±0.121.12±0.231)0.75±0.150.93±0.211)0.79±0.120.98±0.25Th17(%)0.28±0.110.69±0.211)0.29±0.150.59±0.221)0.26±0.120.48±0.201)0.28±0.130.43±0.21Treg(%)10.87±2.937.21±1.861)10.99±2.947.98±1.821)10.98±2.958.36±1.821)10.05±2.569.23±1.93Th1/Th221.38±2.778.19±2.351)21.38±2.7710.12±2.631)21.56±2.7113.23±2.551)21.59±2.9618.26±2.66Treg/Th1738.68±3.1720.17±2.911)38.97±3.2623.19±2.921)38.98±3.1229.47±3.021)38.12±3.1935.19±2.52

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

表2两组儿童JAK2、STAT3、STAT5的mRNA表达水平比较

Tab.2ComparisonofmRNAexpressionlevelsofJAK2,STAT3andSTAT5intwogroups

GroupsControl group A(n=25)Allergic group A(n=27)Control group B(n=22)Allergic group B(n=20)Control group C(n=14)Allergic group C(n=16)Control group D(n=17)Allergic group D(n=15)JAK23.21±0.976.92±1.281)3.26±0.965.78±1.321)3.28±0.914.78±1.291)3.26±0.934.91±1.23STAT33.45±1.037.26±1.231)3.47±1.026.19±1.251)3.42±1.125.25±1.201)3.87±1.174.22±1.27STAT52.93±0.876.25±1.651)2.96±0.865.32±1.091)2.91±0.824.29±1.691)2.90±0.863.29±1.63

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

表3A组JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴细胞亚群的相关性比较

Tab.3ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupA

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT5rPTh1(%)-0.923P<0.05-0.916P<0.05-0.812P<0.05Th2(%)0.918P<0.050.926P<0.050.895P<0.05Th17(%)0.865P<0.050.829P<0.050.917P<0.05Treg(%)-0.816P<0.05-0.178P<0.05-0.838P<0.05Th1/Th2-0.956P<0.05-0.931P<0.05-0.836P<0.05Treg/Th17-0.927P<0.05-0.928P<0.05-0.817P<0.05

表4B组JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴细胞亚群的相关性比较

Tab.4ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupB

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT3rPTh1(%)-0.622P<0.05-0.621P<0.05-0.523P<0.05Th2(%)0.608P<0.050.632P<0.050.498P<0.05Th17(%)0.617P<0.050.529P<0.050.479P<0.05Treg(%)-0.523P<0.05-0.128P<0.05-0.621P<0.05Th1/Th2-0.532P<0.05-0.611P<0.05-0.506P<0.05Treg/Th17-0.635P<0.05-0.508P<0.05-0.502P<0.05

表5C组JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴细胞亚群的相关性比较

Tab.5ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupC

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT5rPTh1(%)-0.321P<0.05-0.308P<0.05-0.312P<0.05Th2(%)0.319P<0.050.321P<0.050.292P<0.05Th17(%)0.309P<0.050.286P<0.050.253P<0.05Treg(%)-0.293P<0.05-0.102P<0.05-0.282P<0.05Th1/Th2-0.276P<0.05-0.293P<0.05-0.265P<0.05Treg/Th17-0.283P<0.05-0.283P<0.05-0.273P<0.05

表6D组JAK2-STAT3/STAT5和CD4+T淋巴细胞亚群的相关性比较

Tab.6ComparisonofcorrelationbetweenJAK2-STAT3/STAT5andCD4+TlymphocytesubsetsingroupD

GroupsJAK2rPSTAT3rPSTAT5rPTh1(%)-0.122P>0.05-0.078P>0.05-0.081P>0.05Th2(%)0.109P>0.050.061P>0.050.053P>0.05Th17(%)0.089P>0.050.092P>0.050.068P>0.05Treg(%)-0.092P>0.05-0.073P>0.05-0.093P>0.05Th1/Th2-0.073P>0.05-0.065P>0.05-0.062P>0.05Treg/Th17-0.065P>0.05-0.058P>0.05-0.038P>0.05

3 讨论

近年来，随着儿童医疗水平的发展，各大器质性儿童疾病的临床治疗均取得了极大的进步[4]。但小儿过敏性疾病却日渐成为目前困扰儿童健康安全的常见疾病，如儿童过敏性哮喘、紫癜以及食物过敏等[5]。由于小儿基础条件较差，免疫功能发育不完善，小儿主要食物牛奶、鸡蛋、大豆等极易成为变态反应原，导致食物过敏现象的发生，不仅影响患儿的健康生活质量，甚至可对生命安全产生威胁[6]。

CD4+T淋巴细胞经刺激后可分化为Th1、Th2、Th17、Treg等亚群，其中Th1型可参与细胞免疫和IFN-γ的分泌，而Th2型主要参与体液免疫和IL-4的分泌[7]。在儿童各大过敏性反应中，Th2型CD4+T淋巴细胞的大量分化和IL-4的分泌可诱发并加重机体过敏反应[8]。此外，由于Th1/Th2型存在相互调控作用，在过敏性患儿体内，Th2的分化和IL-4的大量合成、分泌可抑制CD4+T淋巴细胞的Th1极化[9]。

Treg是最具代表性的具有抑制作用的免疫调节细胞，可广泛在机体内抑制自身免疫反应，诱导免疫耐受，儿童食物过敏患儿Treg的水平明显下调，从而导致免疫抑制失效，诱发和加重过敏现象[10]。此外，Th17作为新型的CD4+T淋巴细胞亚群，以IL-17的分泌为主要特征，较传统的Th1和Th2型，Th17在不同疾病的发生、发展中存在多种调控作用[11]。在多种过敏性疾病中，血清IL17的表达明显升高，且CD4+T淋巴细胞可表现为Th17的极化[12]。

JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条新型信号通路，其信号通路虽然较为简单，但可参与细胞因子刺激的信号转导通路和细胞增殖、分化、侵袭、凋亡、免疫调控等多种重要的生物功能[13]。JAK2属于非受体酪氨酸激酶，而STAT3和STAT5均属于JAK2的底物，JAK2经受体结合活化后可磷酸化STAT3和STAT5，发挥信号调控作用，进而发挥免疫调控作用，调节CD4+T细胞亚群的分布[14，15]。

由于儿童年龄跨度较大，婴幼儿免疫力低下，随着患儿年龄的增长，其免疫系统日趋成熟和完善，故本研究针对患儿进一步采用年龄分组观察，发现对照组A组、B组、C组儿童Th1、Treg淋巴细胞百分比及Th1/Th2、Treg/Th17比值均明显高于过敏组患儿A组、B组、C组，而Th2、Th17淋巴细胞百分比均小于过敏组所对应的同年龄段患儿，随儿童年龄增大，两组间差异均明显减小。并针对患儿JAK2、STAT3、STAT5和CD4+T淋巴细胞亚群水平进行相关性比较，Th1、Treg、Th1/Th2、Treg/Th17的相关性系数均<0(P<0.05)，而Th2、Th17的相关性系数均>0(P<0.05)，且相关系数绝对值随患儿年龄增大明显减小。同时，对照组D组儿童和过敏组D组儿童上述指标差异均无统计学意义,信号通路分子与CD4+T淋巴细胞亚群水平在D组亦无明显相关性。证实低龄食物过敏儿童的JAK2-STAT3/STAT5信号通路存在明显活化和CD4+T淋巴细胞亚群改变现象，且JAK2-STAT3/STAT5信号通路可有效调控CD4+T淋巴细胞亚群的分布，但伴随患儿年龄增大和免疫力的成熟，上述差异和相关性均明显减弱，直至消失。

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