正常和早熟雄性河蟹副性腺蛋白和血淋巴中17β-雌二醇及睾酮浓度的比较

潘颖

（聊城市科学技术情报研究所，山东 聊城 252000）

中华绒螯蟹Eriocheir sinensis（俗称河蟹）肉味鲜美，营养丰富，具有很大的经济价值，进行了较多的研究，如雌性河蟹卵黄物质积累及其转运、卵巢的发育及其中相关营养物质的组成等。而对雄性河蟹的研究则主要是生殖系统的形态学、组织学和组织化学、精荚的形成和精子的发生以及雄性生殖的营养和代谢等[5-8]。

对河蟹血淋巴的研究较多，主要是20-羟基蜕皮酮、17β-雌二醇和睾酮含量的变动[13]和蜕皮过程中血淋巴主要生化成分的变化等[14]。但目前关于河蟹副性腺的研究很少，多数集中在消化精荚及与精子顶体反应等与精子有关的研究，以及副性腺的组织结构，但是对其具体结构和功能尚没有较为系统的报道。

河蟹性早熟严重制约了养殖业的发展，对河蟹性早熟机制的研究有很多，但机理还不清楚。通常认为河蟹性早熟是内因（遗传特性）和外因（盐度[16]、温度、水深、水质、水草、营养过剩、放养密度、饲料搭配和人为管理等）[17]共同作用的结果，还有一些激素分泌的变化。

本研究通过提取正常和早熟河蟹副性腺蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，测定血淋巴中17β-雌二醇和睾酮的含量，以探究正常和早熟河蟹副性腺蛋白和两种激素含量的差异和早熟的机理，为进一步探究河蟹性早熟机理、预防河蟹性早熟及提高河蟹产量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

正常和早熟雄性河蟹购自河北省唐山市曹妃甸区，按李晨虹等的方法[26]，分别挑选性早熟河蟹（体质量 20～30g） 和正常成熟河蟹（体质量95～130g），在水族箱（100cm×40cm×50cm）中暂养，水位10cm左右，循环水，饲养特制玉米（非转基因）。

无钙离子人工海水（Ca2+-FASW）配制：称取NaCl 13.8795g，KCl 0.4473g，MgCl21.425g，Tris碱 1.2114g，加无离子水定容至500mL，pH调至8.2。

凝胶贮液（30%聚丙烯酰胺贮液）配制：称取丙烯酰胺150g，甲叉双丙烯酰胺4g，加无离子水定容至500mL，滤纸过滤后即可使用。

pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取 Tris碱 90.75g，加无离子水定容至500mL，pH调至8.8。

pH6.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris碱12g，加无离子水定容至200mL，pH调至6.8。

10%SDS：称取SDS 1g，加无离子水定容至10mL，混匀。

10%AP：称取AP 1g，加无离子水定容至10mL，混匀。

2×SDS-PAGE上样缓冲液：量取0.5MpH6.8 Tris碱 2.0mL，10%SDS4.0mL，甘油 2.0mL，1%溴酚蓝0.05mL，加无离子水定容至10mL，用时现加巯基乙醇，每1mL上样缓冲液加20μL巯基乙醇。

10×电泳缓冲液：称取Tris碱30g，甘氨酸144g，SDS10g，无离子水 1L，混匀。

脱色液：量取甲醇400mL，冰乙酸100mL，无离子水500mL，混匀。

染色液：称取2g考马斯亮蓝R-250，溶于400mL甲醇、100mL冰乙酸、500mL无离子水中，滤纸过滤后即可使用。

1.2 方法

1.2.1 河蟹副性腺蛋白的提取

随机挑取正常和早熟雄性河蟹各4只，解剖取出副性腺，用预冷的无钙离子人工海水冲洗两次后，冰浴匀浆，4℃1 000r/min离心5min，弃沉淀，取上清再4℃10 000r/min离心10min，取上清分装于小管中。每只河蟹的副性腺蛋白分别标记为正常1、正常 2、正常 3、正常 4、早熟 1、早熟 2、早熟 3及早熟4，-80℃冰箱保存。

1.2.2 河蟹副性腺蛋白浓度测定

用考马斯亮蓝法[26]测定获得的水溶性蛋白质的浓度：

取8支离心管，分别加入4只早熟和4只正常河蟹的副性腺蛋白10μL，再分别加入90μL无离子水，再加入考马斯亮蓝G-250试剂1.0mL，立即在旋涡振荡器上混匀，加完试剂2～3min后，按顺序将200μL样品加到96孔板的样品孔中，用预热的酶标仪测定A595，再根据测得的标准曲线即可计算未知样品的蛋白质含量和蛋白浓度，计算SDS-PAGE凝胶电泳中的合适上样量。

1.2.3 河蟹副性腺蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳

按表1所示配制12%的分离胶和3.6%的浓缩胶。

用0.02%考马斯亮蓝R-250染液摇床染色过夜，含有10%冰乙酸的脱色液摇床脱色，直到凝胶上的条带清晰可见。将凝胶放入扫描仪中，用QuantityOne软件进行图像扫描。

表1 分离胶和浓缩胶的配制Tab.1 The preparation of the separation and enrichment adhesives

1.2.4 河蟹血淋巴激素浓度测定

随机取3只正常和6只早熟的河蟹，由河蟹第三步足的最后一个关节收集血淋巴[14]，4℃过夜，20000r/min4℃离心10min，弃沉淀，上清1000r/min离心2min，再取上清，分装，-20℃冰箱保存。每只正常河蟹的血淋巴为一组样本，每2只早熟河蟹的血淋巴为一组样本。

将500μL血淋巴样品送至保定市妇幼保健医院，测定17β-雌二醇和睾酮浓度。

2 结果与分析

2.1 河蟹副性腺蛋白浓度

由图1的标准曲线可以得到公式：

y=0.0133x+0.2523，将计算得到的蛋白含量（μg）除以 10即可得副性腺蛋白浓度（μg/μL）。正常和早熟河蟹副性腺中蛋白浓度见表2。

图1 河蟹副性腺中蛋白浓度标准曲线Fig.1 A standard curve of concentrations of protein in sexual accessory gland in Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

2.2 河蟹副性腺蛋白SDS-PAGE凝胶电泳

根据测得的蛋白浓度，取等量的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，根据蛋白浓度，以及能在凝胶上得到清晰条带的蛋白量，选取蛋白量为9.78μg。由于是将蛋白样品与上样缓冲液等体积混合，因而上样量 =9.78μg/蛋白浓度（μg/μL）×2。

图2 正常和早熟河蟹副性腺蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE gel electrophoresis of sexual accessory gland in normal and precocious Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

由图2可知，正常和早熟雄性河蟹副性腺中蛋白的条带存在差异，除去实验中的误差和个体间的差异，蛋白条带数及其分布无明显差异。但是，早熟雄性河蟹副性腺66.4～97.2kDa的蛋白条带颜色明显浅于正常雄性河蟹，表明早熟雄性河蟹副性腺中66.4～97.2kDa蛋白的表达量低于正常雄性河蟹副性腺。

用QuantityOne软件对得到的凝胶电泳图谱进行灰度分析（图3）。

如图3所示，早熟雄性河蟹副性腺蛋白的灰度值明显低于正常雄性河蟹副性腺蛋白的灰度值，主要是SDS-PAGE凝胶图谱中分子量在66.4～97.2kDa间的蛋白条带。这说明在早熟雄性河蟹副性腺中66.4～97.2kDa间的蛋白表达量低于正常雄性河蟹。

2.3 河蟹血淋巴激素的浓度

由表4和表5可知，正常雄性河蟹血淋巴中睾酮和17β-雌二醇的浓度显著高于早熟雄性河蟹。t检验表明，正常和早熟雄性河蟹血淋巴中睾酮和17β-雌二醇浓度差异非常显著（P＜0.001）。姜仁良等[13]曾研究不同蜕皮周期的河蟹血淋巴中睾酮和17β-雌二醇的含量，发现雄性河蟹的血淋巴中睾酮含量在成熟前的蜕皮期不断上升，在精巢成熟前一个月达到峰值，因而睾酮具有诱导精巢发育的作用。在成熟后7月、8月、9月也出现峰值，说明睾酮具有提高新陈代谢的强度、促进生长的作用。

表2 正常和早熟河蟹副性腺蛋白浓度Tab.2 The protein concentrations in sexual accessory gland in normal and precocious Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

图3 正常和早熟河蟹副性腺蛋白SDS-PAGE灰度分析扫描对比图Fig.3 SDS-PAGE gray scanning contrast of sexual accessory gland in normal and precocious Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

表4 正常和早熟雄性河蟹血淋巴中睾酮浓度Tab.4 The testosterone concentrations in the hemolymph of normal and precocious male Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

表5 正常和早熟雄性河蟹血淋巴中17β-雌二醇浓度Tab.5 17 beta estradiol levels in the hemolymph of normal and precocious male Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

3 讨论

副性腺蛋白常用于消化精荚[8,10]，表明在副性腺蛋白中存在一些蛋白可导致精荚壁破裂。SDS-PAGE凝胶电泳分析显示：不同时期的雄性河蟹副性腺蛋白质种类变化不大，只是成熟雄性河蟹副性腺在66.4～97.2kDa间的蛋白条带的表达量多于其他未成熟时期的雄性河蟹。本研究没有具体分析这些蛋白质对雄性生殖的作用以及在雄性河蟹成熟过程中的作用。

正常和早熟雄性河蟹的副性腺蛋白质种类和分布无明显差异，但是,早熟雄性河蟹副性腺中分子量在66.4～97.2kDa间的蛋白质表达量明显少于正常雄性河蟹副性腺的蛋白表达量，这一区域的未成熟时期的雄性河蟹的蛋白表达量也少于成熟雄性河蟹副性腺。由此可以推出，虽然早熟雄性河蟹性腺已发育成熟，但是分子量在66.4～97.2kDa间的副性腺蛋白表达量仍然低于正常雄性河蟹，而这一区别可能对性腺的发育没有影响，但可能影响机体中其他组织器官的生长发育，成为早熟雄性河蟹性腺发育成熟但个体较小且死亡率高的原因之一。

在本研究中，正常雄性河蟹血淋巴中睾酮和17β-雌二醇的浓度都维持在一个较高的水平，显著高于早熟雄性河蟹。由此可知，虽然早熟雄性河蟹性腺已经发育成熟，但是激素水平与正常雄性河蟹相比仍然较低，可能影响机体中其他组织器官的生长发育，影响河蟹机体的生长，是早熟雄性河蟹性腺提早发育成熟但是个体仍然较小且死亡率高的原因之一。

本研究发现，早熟雄性河蟹分子量在66.4～97.2kDa间的副性腺蛋白的表达量明显少于正常雄性河蟹，早熟雄性河蟹血淋巴中睾酮和17β-雌二醇的浓度显著低于正常雄性河蟹。由此说明分子量在66.4～97.2kDa间的副性腺蛋白，睾酮及17β-雌二醇这两种激素，与河蟹性早熟有一定的关联，与早熟雄性河蟹性腺提早发育成熟，进而导致其个体较小且死亡率高有关，从而为进一步研究河蟹性早熟机理、预防河蟹性早熟提供了基础依据。

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