His-CDs@NaTbF4的合成及其在组氨酸检测和肿瘤细胞成像中的应用

刘 玲 李瑞怡 来 婷 李在均 顾志国

（江南大学化学与材料工程学院，无锡 214122）

0 引 言

碳点（carbon dots，CDs）是尺寸小于 100 nm 的碳纳米材料，包括石墨烯量子点等。碳点具有比表面积大、载流子迁移率高、柔性、热稳定好和化学惰性等特点[1]。相对于有机荧光染料、贵金属纳米簇、荧光蛋白和半导体量子点，碳点具有更高的发光效率、生物相容性和抗漂白能力[2]。目前，碳点已应用于生物传感、细胞成像、药物传输、光电子器件等领域[3-6]。提高碳点光学性能的主要方法是异原子掺杂和功能化。掺杂是指在骨架碳结构中引入其他原子。杂原子可改变碳点的电子分布和带隙间距，实现对光电性能的有效调节[7]。Lu小组通过热解邻苯二胺和多巴胺的混合物得到一种能近红外荧光发射的氮掺杂碳点[8]。功能化是在碳片边缘引入特定化学活性基团或结构单元[9]。Hola小组以没食子酸衍生物为前驱体水热合成了烷基链功能化碳点[10]。研究发现，通过改变烷基种类可实现对碳点亲水性和疏水性的有效调节，呈现出羧基诱导下的荧光红移现象。

稀土氟化物具有宽带隙、低声子能量、高热的特性和环境稳定性，是一种重要的发光材料[11]。稀土氟化物的发光性能取决于它的组成，不同的发光稀土和基质稀土组合将产生不同颜色的荧光发射[12]。例如，NaTbF4和NaEuF4因稀土电子跃迁能级不同分别发出明亮的绿光和红光。此外，晶型、粒径及表面修饰也不同程度地影响稀土氟化物的发光性能。为此，人们开发出许多稀土氟化物合成方法。其中，以溶剂热法和水热法最为常用[13-14]。溶剂热法通常采用油酸、十八烯等有机溶剂为介质制备稀土氟化物晶体。溶剂热法制备的稀土氟化物尺寸较小且均一，更适合细胞和生物体内的光学检测与成像，但合成条件苛刻，所制备的氟化物因水溶性差需要改性后方可使用。相对于溶剂热法，水热法具有操作简单和产品结晶度好的特点。Luo小组研究水热合成六方相NaTbF4，发现Eu3+掺杂能调节NaTbF4的荧光发射。Eu3+掺杂量增加到1%时NaTbF4的荧光由绿色转化为红色[15]。然而，传统水热法制备的稀土氟化物粒径偏大，极大地限制了它们在生物分析等领域的应用。

碳点和稀土氟化物是各具特色的发光材料，它们的结合可能导致不同寻常的性质及相关应用。最近，加拿大多伦多大学的Krull小组利用稀土氟化物与石墨烯量子点之间的荧光共振能量转移，实现了对人血清中大肠杆菌、痢疾志贺菌和抗四环素生物标记物的同时检测[16]。碳点通过2条互补DNA单链的杂交与稀土氟化物彼此接近，伴随着共振能量转移石墨烯量子点的荧光下降。因不同材料间存在较大距离，能量转移的效率非常有限。为了克服这一问题，我们以组氨酸功能化碳点（His-CDs）为稳定剂，采用水热法合成了一种His-CDs@NaTbF4复合材料。研究表明，碳点对NaTbF4晶体的包覆提高了水溶性，复合物在水中能长期稳定。碳点与NaTbF4的共价结合实现了稀土粒子向碳点的高效能量转移，导致显著的荧光增强。该复合材料成功地应用于人体尿液中组氨酸测定和Hela细胞成像。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

所用仪器有：JEM-2100（HR）透射电子显微镜（日本 JEOL公司）；Nicolet iS50 FT-IR傅立叶红外光谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Cary Esclipse荧光光度计（美国瓦里安公司）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司）；D8 Advance型X射线衍射仪 （德国Bruker AXS公司），XRD 测试条件：Cu Kα 射线 （λ=0.154 nm）， 管电压40 kV，管电流 300 mA，扫描范围 5°～90°。

TbCl3·6H2O、NaF、CuSO4和组氨酸购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BR缓冲溶液：H3PO4、乙酸和 H3BO3浓度均为 0.04 mol·L-1，用 0.02 mol·L-1NaOH溶液在pH计上调节到所需要的pH值。His-CDs按文献方法合成[17]。其它试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂公司。实验用水为二次去离子水。

1.2 His-CDs@NaTbF4制备

将 TbCl3·6H2O（5 mmol）溶 于 去 离 子 水 中 （15 mL），缓慢滴加 His-CDs溶液（5 mg·mL-1，100 mL），搅拌 30 min。滴加 1.0 mol·L-1NaF 水溶液（60 mL）于上述混合溶液，强力搅拌1 h后转移至压力反应釜中，于180℃ 反应4 h，冷却至室温，收集上清液，高速离心（10 000 r·m-1）20 min 去除游离的 His-CDs，沉淀用水洗涤3次，冷冻干燥得到His-CDs@/NaTbF4固体样品。称取一定量的His-CDs@NaTbF4溶解于水中配成0.3 mg·mL-1的储备液，在4℃冰箱中避光保存，备用。

1.3 荧光测定

移取200 μL His-CDs@NaTbF4水溶液于5 mL离心管，加入600 μL pH 7的BR缓冲溶液，加水定容至1 mL，混匀，倒入1 cm石英比色皿中，然后在荧光分光光度计上选择激发波长为340 nm进行荧光光谱扫描或荧光强度测定。

1.4 共振光散射光谱测定

在2 mL离心管中，依次加入200 μL Cu2+标准溶液、600 μL BR 缓冲溶液（pH=7）和 200 μL His-CDs@NaTbF4水溶液，摇匀，然后在荧光光度计上选择激发波长等于发射波长进行同步扫描测定共振光散射光谱。

1.5 组氨酸检测

在2 mL离心管中，依次加入200 μL 1.0×10-2mol·L-1Cu2+标准溶液、400 μL BR 缓冲溶液（pH=7）和200 μL His-CDs@NaTbF4溶液，摇匀，加入200 μL组氨酸标准溶液或样品溶液，在荧光光度计上进行荧光光谱扫描或荧光强度测定。

1.6 细胞成像

将Hela细胞转移到含有10%FBS和1%青霉素-链霉素的 DMEM 中，37 ℃、5%（V/V）CO2和 95%（V/V）空气的潮湿环境下培养。成像实验前，将细胞转移至共聚焦专用培养皿，培养6 h后用5 mL pH=7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次。将此细胞注入30 mg·mL-1His-CDs@NaTbF4溶液， 于37℃和5%（V/V）CO2的条件下培养 4 h，用 5 mL pH=7.4 的 PBS洗涤3次去除残余His-CDs@NaTbF4，然后在共聚焦荧光显微镜上选择490 nm激发光进行荧光成像。

2 结果与讨论

2.1 His-CDs@NaTbF4合成

His-CDs@NaTbF4合成包括制备His-CDs-Tb和NaTbF4的形成2个步骤。首先，His-CDs通过咪唑氮和羧基氧与Tb3+结合形成稳定的His-CDs-Tb配合物[18]。在配位反应过程中，随着His-CDs的加入TbCl3溶液由透明状逐步转变为混浊，直到产生大量沉淀。这是因为每个碳片含有多个咪唑基团和羧基，不同碳片之间可以通过“Tb3+桥”连接在一起，碳片聚合导致配合物水溶性显著下降而最终从体系中沉淀析出。沉淀完全后，向体系中加入NaF，并在180℃下水热反应产生His-CDs@NaTbF4复合物。这一过程中，F-将替代His-CDs-Tb配合物中His-CDs配体而最终形成NaTbF4晶体。一方面，His-CDs对Tb3+的缓释作用可有效调控NaTbF4晶体生长，从而形成细小且结晶度高的NaTbF4晶体。另一方面，碳片共价键合于NaTbF4晶体表面形成亲水性包覆层，改善了NaTbF4的水溶性。此外，碳片上含氧基团的离解造成粒子表面带负电荷，强的静电排斥进一步提高了His-CDs@NaTbF4水溶液稳定性。

图1是His-CDs的TEM图和His-CDs@NaTbF4的TEM、晶格指纹和XRD图。从图1可以看出，His-CDs碳片呈现为准零维材料，其碳片尺寸较小，直径仅为1～3 nm，没有明显的团聚。NaTbF4具有明显的六方晶型结构，晶体大小均一，尺寸在4～6 nm之间，明显小于传统水热法和溶剂热法所制备的稀土氟化物[19-20]。 晶格指纹图包含His-CDs的（002）和NaTbF4的（110）衍射峰的晶格。复合物的XRD图上有 5 个衍射峰，分别位于 17.1°、29.8°、30.4°、42.9°和53.1°，对应于（100），（110），（101），（201）和（211）晶面。这些衍射峰都能在标准卡片中找到（PDF#27-0809），证明形成了六方相NaTbF4。图1D中XRD衍射峰呈现强而尖的特征，说明NaTbF4有高的结晶度。热重分析揭示His-CDs@NaTbF4含有33.19%的His-CDs，然而图1D中并未出现碳材料在22°处的特征衍射峰。这主要是因为His-CDs是一种准零维纳米材料，低结晶度降低了在22°处XRD衍射峰的强度。相对于NaTbF4晶体的强衍射峰，His-CDs的衍射峰弱到几乎观察不到的程度。

图2是His-CDs@NaTbF4的EDS图和红外光谱。 EDS 分析表明，复合物主要是由 C、N、O、Tb、Y和F元素组成。因为C、N和O主要来源于His-CDs，而Tb、Y和F来源于NaTbF4，上述结果证明复合物中含有His-CDs和NaTbF4。His-CDs@NaTbF4的红外光谱存在5个强的红外吸收峰和吸收带。3 400 cm-1附近的宽峰是O-H和-N-H键伸缩振动产生的红外吸收。1 700 cm-1附近的强峰是-C=O键伸缩振动产生的红外吸收。1 380 cm-1和1 150 cm-1的吸收峰证实-COOH存在。1 650 cm-1处有一明显的吸收峰对应咪唑基团中C＝N伸缩振动红外吸收。图2A中还有许多弱的吸收峰和吸收带，它们相似于His-CDs的红外吸收，说明在水热反应过程中His-CDs的主要功能基团得以较好地保留。

2.2 NaTbF4对His-CDs荧光增强

图1 His-CDs的 TEM 图 （A）和 His-CDs@NaTbF4的 TEM （B）、晶格指纹 （C）和 XRD 图 （D）Fig.1 TEM image （A）of His-CDs and TEM image （B）,lattice fringe image （C）and XRD patterns （D）of His-CDs@NaTbF4

图2 His-CDs@NaTbF4的 EDS图 （A）和红外光谱 （B）Fig.2 EDS image （A）and IR spectrum （B）of His-CDs@NaTbF4

His-CDs@NaTbF4和His-CDs的荧光光谱列于图3A。His-CDs@NaTbF4的荧光光谱明显不同于His-CDs。His-CDs的荧光光谱具有较好的对称性，最大荧光发射波长为440 nm。His-CDs@NaTbF4有一不对称的荧光光谱，最大荧光发射峰移到425 nm。这是因为His-CDs@NaTbF4是由 His-CDs和NaTbF4复合而成，His-CDs@NaTbF4的荧光光谱包括了His-CDs和NaTbF4两种材料的荧光发射。图3A还显示，His-CDs@NaTbF4有更强的荧光发射，峰荧光强度超过His-CDs的7倍，这说明His-CDs和NaTbF4的结合能产生显著的荧光增强，且荧光增强效果优于文献报道（表1）。为了探讨荧光增强机理，分别测定了NaTbF4的荧光光谱和His-CDs的吸收光谱。从图3B可以看出，NaTbF4的荧光光谱位于240～660 nm之间，而His-CDs的吸收光谱覆盖了250～800 nm的波长范围。NaTbF4的荧光光谱与His-CDs的吸收光谱有很大程度的重叠，这符合产生荧光共振能量转移的条件。因此，His-CDs@NaTbF4的荧光强于His-CDs应归于His-CDs和NaTbF4之间的共振能量转移。在这一过程中，NaTbF4作为能量供体将能量迅速转移给His-CDs，带来His-CDs发光效率的大幅提升。大量研究表明，供体和受体之间的距离是影响荧光共振能量转移增强的关键因素。His-CDs是通过N-Tb共价键的方式与NaTbF4相结合，它们之间的距离仅为一个共价键的键长，能量供体和受体之间如此短的距离使NaTbF4能高效地向His-CDs转移能量，从而产生更高的荧光增强效应。

图3 （A）His-CDs@NaTbF4和His-CDs的荧光光谱;（B）His-CDs的紫外-可见吸收光谱和NaTbF4的荧光光谱Fig.3 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4and His-CDs;（B）UV-visible absorption spectrum of His-CDs and fluorescence spectrum of NaTbF4

表1 不同方法荧光增强效果的比较Table 1 Comparison of different fluorescence enhancement methods

2.3 对Cu2+和组氨酸的光学响应

为了研究His-CDs@NaTbF4对 Cu2+的荧光响应，分别测定了Cu2+加入前后His-CDs@NaTbF4的荧光光谱。图4A呈示，Cu2+的加入引起了一个明显的荧光猝灭过程。由于His-CDs@NaTbF4的His-CDs含有能与Cu2+发生反应的咪唑基团，上述荧光猝灭可归因于N-Cu键的形成。由于N-Cu形成过程中碳片上的部分能量将转移到Cu2+离子，从而导致其荧光强度的下降。此外，用共振光散射技术研究了Cu2+加入His-CDs@NaTbF4粒子大小的影响。从图4B可以看出，随着铜离子浓度增加，His-CDs@NaTbF4的共振光散射光谱强度迅速增大，说明Cu2+加入导致His-CDs@NaTbF4粒子变大。每一个His-CDs碳片中含有多个咪唑基，它与Cu2+的配位可能发生在不同碳片之间，造成粒子尺寸的迅速增加。

图4 （A）在 2.0 mmol·L-1Cu2+存在下 （a）和缺少 Cu2+的情况下 （b）His-CDs@NaTbF4 溶液的荧光光谱;（B）在不同浓度 Cu2+存在下His-CDs@NaTbF4溶液的共振光散射光谱Fig.4 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4solution in the presence of 2.0 mmol·L-1Cu2+ （a）and the absence of Cu2+ （b）;（B）Resonance Rayleigh scattering spectra of His-CDs@NaTbF4 solution in the presence of Cu2+with different concentrations

图5 His-CDs@NaTbF4-Cu 加入组氨酸前 （a）后 （b）的荧光光谱Fig.5 Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4-Cu before （a）and after addition of histidine （b）

在His-CDs@NaTbF4溶液中加入适量的Cu2+可将其全部转化为相应的配合物。研究发现，猝灭的荧光能被组氨酸恢复 （图5）。在体系中加入组氨酸后，组氨酸将同His-CDs竞争与Cu2+配位。组氨酸的配位能力略强于His-CDs，因此组氨酸能分解His-CDs@NaTbF4-Cu而生成His-Cu配合物。同时，释放出His-CDs@NaTbF4，从而导致体系荧光增加。

2.4 组氨酸检测的荧光“开-关”体系

基于His-CDs@NaTbF4对Cu2+和组氨酸的荧光响应行为，构建了测定组氨酸的荧光“开-关”方案（图6）。在这个荧光“开-关”方案中，先加入 Cu2+猝灭His-CDs@NaTbF4的荧光，体系处于荧光“关”状态。然后，加入组氨酸分解前面所形成的配合物，同时释放出His-CDs@NaTbF4使体系的荧光得到一定恢复，体系处于荧光“开”状态。利用荧光“开”和“关”产生的信号变化可定量测定组氨酸。以上分析方案中，Cu2+发挥着至关重要的作用。为此，我们测定了不同Cu2+存在下体系的荧光变化。结果表明，随着Cu2+浓度增加体系的荧光强度迅速下降。当Cu2+的浓度达到2 mmol·L-1时，荧光猝灭程度达到最大。继续增加Cu2+浓度体系荧光强度不再降低，表明His-CDs@NaTbF4已被完全转化为相应的配合物。对于组氨酸的分析而言，选择一个较小浓度的Cu2+浓度组氨酸荧光恢复的范围较小，导致一个相对窄的线性范围。选择一个过高的Cu2+浓度体系中将存在游离Cu2+，这些游离Cu2+更容易与组氨酸反应形成稳定的配合物。由于这种反应并不产生荧光信号的变化，导致分析结果失真。为了得到宽的线性范围和高的可靠性，选取Cu2+浓度为2.0 mmol·L-1用于组氨酸检测的荧光“开-关”体系构建。

图6 组氨酸检测的荧光“开-关”方案Fig.6 Fluorescence “On-Off” scheme for detection of histidine

为验证荧光“开-关”方案用于微量组氨酸测定的可行性，配制一系列His-CDs@NaTbF4-Cu溶液，分别加入不同量的组氨酸，然后测定它们的荧光光谱和峰荧光强度。图7显示，体系的荧光随组氨酸浓度的增加而增大。当组氨酸浓度在1.0×10-6～2.0×10-4mol·L-1之间，峰荧光强度与组氨酸浓度有良好线性关系。其线性方程为：I=1 072.7c/（mmol·L-1）+169.12，相关系数R=0.995 6，方法检出限达到3.8×10-7mol·L-1（S/N=3）。 采 用此 方 法测 定 15 个 0.1 mmol·L-1组氨酸，检测结果标准偏差为1.4%，表明方法具有良好的重现性。将His-CDs@NaTbF4-Cu储备液在4℃储存一定时间，然后用于检测0.1 mmol·L-1组氨酸。储备液储存1个月后测定结果相对偏差小于1.9%，表明分析体系有较好的稳定性。

图7 （A）在不同浓度的组氨酸存在下His-CDs@NaTbF4-Cu溶液的荧光光谱;（B）His-CDs@NaTbF4-Cu的荧光强度与组氨酸浓度的关系曲线Fig.7 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4-Cu solution in the presence of histidine with different concentrations;（B）Linear relationship of fluorescence intensity of His-CDs@NaTbF4-Cu with histidine concentration

生物样品中主要的无机离子是Na+、Ca2+、Mg2+、CO32-、SO42-和 PO43-。 加入 1.0 mg 的上述离子后，仅带来His-CDs@NaTbF4-Cu体系荧光强度小于5%的变化。这是因为上述离子本身不能与复合物发生反应形成稳定化合物，也不能将Cu2+从其配合物中置换出来。对生物样品而言，天然氨基酸最有可能干扰组氨酸的测定。图8代表不同天然氨基酸存在下His-CDs@NaTbF4-Cu体系的荧光变化。从图8可以看出，唯有组氨酸的加入能引起明显的荧光变化。不同于其他氨基酸，组氨酸分子中含有咪唑基，咪唑基对过渡金属离子具有强的配位能力，因此组氨酸与铜离子形成配合物的能力最强。由于其他氨基酸的引入并不能分解His-CDs@NaTbF4-Cu配合物，所以不干扰组氨酸测定。

表2 人体尿液中组氨酸的测定（N=5）Table 2 Analytical results of histidinein human urine （N=5）

图8 不同天然氨基酸对体系荧光强度的影响Fig.8 Effect of natural amino acids on the fluorescence intensity of the system

2.5 人体尿液中组氨酸检测

征集3位健康的自愿者，将他们的1.0 mL尿样与0.2 mL乙腈充分混合，在3 500 r·min-1下离心10 min，收集的上清液用于组氨酸测定。回收实验是在尿样中加入已知浓度的组氨酸标准溶液，然后按实验方法测定组氨酸浓度，并以此计算回收率。从表2可以看出，测定结果与LC-MS方法相一致，组氨酸回收率95.2%～104.5%，说明方法具有较好的准确性和精密度。

2.6 细胞成像

采用CCK-8方法对His-CDs@NaTbF4的细胞毒性进行测试。结果表明，His-CDs@NaTbF4浓度在0～1 mg·mL-1之间细胞活力保持基本不变，说明His-CDs@NaTbF4具有非常低的细胞毒性。

将Hela细胞在 His-CDs@NaTbF4中孵育 2 h，然后在共聚焦显微镜上进行荧光成像。如图9所示，His-CDs@NaTbF4处理的细胞产生绿色荧光，说明His-CDs@NaTbF4已进入到细胞内部。然而，在同样条件下用His-CDs处理的细胞荧光却很弱。可见，His-CDs@NaTbF4低的细胞毒性和强的荧光发射，能广泛应用于生物成像。

图9 Hela细胞在His-CDs（左）和 His-CDs@NaTbF4（右）中孵育后的明场 （上）和荧光显微照片 （下）Fig.9 Bright field image （up）and confocal fluorescence microscopy image （down）of the Hela cells incubated with His-CDs （left）and His-CDs@NaTbF4 （right）

3 结 论

以组氨酸功能化碳点为稳定剂通过水热合成得到一种粒径小、结晶度高和易分散于水的稀土氟化物His-CDs@NaTbF4。碳点与稀土氟化物共价连接可实现能量由稀土氟化物向碳点的高效转移，导致显著的荧光增强效应。碳点-稀土氟化物复合物具有低的细胞毒性和强的荧光发射，可作为荧光探针广泛应用于各种生物检测与成像。研究结果还为开发基于稀土或碳点的功能材料提供了方法和理论指导。

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