盆舒颗粒对宫腔黏连模型大鼠子宫内膜TGF-β 1、Smad3的影响

蒋敏，赵宏利，杨汉铭

杭州市中医院，浙江 杭州 310007

宫腔黏连(IUA)是子宫内膜的一种损伤性疾病，临床表现为经期腹痛、月经量少、闭经、不孕等[1]。近年来随着人工流产率的增加，宫腔黏连发病率逐年上升。有报道指出：宫腔黏连的发生有90%以上系刮宫所致[2]，其发病机制可能与体内促进或抑制组织纤维化的细胞因子转化生长因子-β1(TGF-β1)、金属蛋白酶9(MMP-9)发生变化有关。本研究采用自制刮宫勺刮伤大鼠子宫内膜，制作符合宫腔黏连发病机制的模型，观察盆舒颗粒对宫腔黏连大鼠子宫TGF-β1、信号传导蛋白(Smad3)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用成年雌性SD大鼠50只，体质量(230±20)g，由浙江省实验动物中心提供，符合国家动物实验设施屏障环境标准，动物实验条件合格证号：SYXK(浙)2008-0113。

1.2 药物、试剂和设备 中药制剂“盆舒颗粒”，由当归、炒白术、延胡索、红藤、浙贝母、王不留行子等中药组成，由杭州市中医院制成颗粒剂。兔抗鼠TGF-β1抗体、兔抗鼠Smad3抗体、兔免疫组化试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；光学显微镜(蔡司光学仪器上海国际贸易有限公司)。

1.3 分组和模型的建立 利用SPSS13.0软件将选用的50只SD大鼠随机分为5组，即正常组、模型组、中药治疗组，TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组，每组10只。除正常组外，其他4组大鼠用戊巴比妥钠(浓度为0.4%)腹腔注射麻醉大鼠(50mg/kg)后，无菌条件下，取下腹正中切口约0.8～1.0 cm，开腹后暴露并固定子宫，用自制小刮勺刮伤子宫内膜，连续缝合完全关闭切口。需TGF-β1抗体干预的2组实验大鼠在关腹前将TGF-β1抗体注入子宫后关腹。

1.4 造模后处理 各组大鼠均于造模后第2天开始灌胃给药。中药治疗组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组：每天按体表面积给予等效剂量的盆舒颗粒，按每只大鼠10 g/(kg·d)灌胃给药，正常组、模型组、抗体干预组给予等容量生理盐水，共14天，中药治疗组、TGF-β1抗体干预组由于灌胃失误导致各有1只大鼠死亡，其余各组大鼠无死亡，将大鼠称体质量后，开腹，手术摘取双侧子宫，将供HE染色、免疫组化检测的组织放入到10%甲醛中固定。

1.5 HE染色及免疫组化法 HE染色方法：(1)烘片：37℃过夜；(2)脱蜡：二甲苯I，5min；二甲苯II，15min；无水酒精，1min；95%酒精，1min；80%酒精，2min；自来水洗，3次；(3)染色：苏木素染液，5min；自来水洗，3次；伊红酒精，2min；(4)透明、固封：80%酒精，1min；95%酒精I，2min；95%酒精 II，5 min；无水酒精 I，10 min；无水酒精 II，10 min；二甲苯I，5min；二甲苯II，5min；中性树胶封片。免疫组织化学检测方法：(1)60℃烤片2 h；(2)脱蜡，二甲苯脱蜡15min，3次；(3)水化，依次经过无水乙醇，95%，90%，80%，70%，各5min，蒸馏水5min；(4)PBS洗5min，3次；(5)热修复抗原：枸橼酸盐缓冲液(约92～95℃)煮沸(沸水浴)修复15min，自然凉至室温。PBS洗5min，3次；(6)3%双氧水封闭20 min，PBS洗5 min，3次；(7)正常山羊血清封闭，37℃ 20min；(8)一抗孵育，4℃ 过夜；(9)复温20min，PBS洗5min，3次；(10)二抗孵育，37℃ 20min(二抗为生物素标记的羊抗兔IgG)PBS洗5min，3次；(11)DBA显色；(12)苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。

1.6 观察指标及检测方法 采用光学显微镜观察各组大鼠子宫组织的光镜形态学变化，病理分级标准见表1。采用免疫组化法检测各组大鼠子宫组织中TGF-β1，Smad3表达情况。1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

2 结果

2.1 各组大鼠子宫病变程度比较 见表2。经Ridit分析，除模型组外，其他各组Ridit值均小于0.5。模型组与正常组95%可信区间无重叠，说明有显著性差异；模型组与中药治疗组、TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组95%可信区间均无重叠，说明有显著性差异；中药治疗组与TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组95%可信区间重叠，说明无显著性差异。结果还提示：3个治疗组间存在疗效差异，由于病变程度等级是按“好”到“差”排列，所以Ridit值最小者疗效最优，故TGF-β1抗体干预+中药治 疗组疗效最好。

表1 病理分级标准分

表2 各组大鼠子宫病变程度比较

2.2 各组大鼠子宫内膜上皮细胞TGF-β1表达比较 见表3。与正常组比较，模型组大鼠子宫内膜上皮细胞TGF-β1表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，中药治疗组、TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组大鼠子宫内膜上皮细胞TGF-β1表达显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。中药治疗组、TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组3组之间比较无统计学差异(P＞ 0.05)。

表3 各组大鼠子宫内膜上皮细胞TGF-β1表达比较(±s)

表3 各组大鼠子宫内膜上皮细胞TGF-β1表达比较(±s)

与正常组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常组模型组中药治疗组TGF-β1抗体干预组TGF-β1抗体干预+中药治疗组n 10 10 99 10 TGF-β1 10.000 0±1.563 4 13.500 0± 0.849 8①11.444 4± 1.236 0②11.000 0± 1.500 0②10.500 0± 1.354 0②

2.3 各组大鼠子宫内膜上皮细胞Smad3表达比较 见表4。与正常组比较，模型组大鼠子宫内膜上皮细胞Smad3表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，中药治疗组、TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组大鼠子宫内膜上皮细胞Smad3表达显著下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)。中药治疗组、TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组3组之间比较无统计学差异(P＞ 0.05)。

表4 各组大鼠子宫内膜上皮细胞Smad3表达比较(±s)

表4 各组大鼠子宫内膜上皮细胞Smad3表达比较(±s)

与正常组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常组模型组中药治疗组TGF-β1抗体干预组TGF-β1抗体干预+中药治疗组n 10 10 99 10 Smad3 8.400 0±1.712 7 13.500 0± 1.354 0①9.555 6± 1.424 0②9.4444± 1.424 0②9.200 0± 1.316 5②

3 讨论

宫腔黏连为现代医学病名，散见于中医月经过少、闭经、腹痛等病证之中。宫腔手术损伤胞宫气血，扰乱肾—天癸—冲任—胞宫轴，导致肾气亏损，精血匮乏，冲任失养，胞脉空虚，不能按时蓄溢；《景岳全书·妇人规》曰：“瘀血留滞作癥，唯妇人有之，其证则或由经期，或由产后，凡内伤生冷，或外受风寒……总由血动之时，余血未净，而一有所逆，则留滞日积，而渐以成癥矣”，而后余血未净，邪气乘虚入侵与血搏结，凝结成瘀，内阻胞宫。现代中医研究表明，气滞血瘀、脾虚失运、湿浊内阻会引起黏连性腹痛[4]，也有学者认为宫腔黏连术后月经量少的主要病机以肾虚为本，血瘀为标[5～6]。

本课题组在继承古人理论的基础上，结合现代医学知识，根据宫腔黏连临床表现及危害特点，归纳宫腔操作后宫腔黏连病因病机，主要为虚、瘀、湿三端。针对宫腔黏连的发病特点，运用传统的中医经典理论，在继承老中医学术经验的基础上，总结“通经养血，散结除湿”治法，创立中药复方“盆舒颗粒”：当归乃补血之圣药，和血补血；白芍养血敛阴，柔肝止痛；白术为脾脏补气健脾第一要药；泽泻、茯苓渗水利湿，利尿消肿；川芎是血中之气药，活血行气止痛，善“下调经水，中开郁结”；上六味源自《金匮要略》当归芍药散，旨在疏肝健脾，活血化瘀，健脾利湿，佐以延胡索活血散瘀，利气止痛；莪术破血行气消积；红藤清热解毒除湿；使以牛膝逐瘀通经，引血下行；浙贝母清热化痰，散结消痈；王不留行子活血通经。合方共奏活血化瘀、通经祛湿止痛之效。

TGF-β是一种强效免疫抑制因子，在急性炎症反应中，该因子可以增加巨噬细胞对炎性细胞和受损伤实质细胞的吞噬作用，同时抑制组织中的巨噬细胞活性。TGF-β可直接增加间质蛋白质的合成与分泌，促进胶原与基质的黏附作用，参与最初的炎性反应、血管形成、胶原沉积以及最终组织塑形，是诱导瘢痕形成的重要因子，在宫腔黏连患者子宫内膜中呈高表达[7～8]。Smad蛋白是转化生长因子信号转导通路中关键的介质，可将信号由细胞膜转至细胞核，使得TGF-β能在不同的环境下发挥它的多种功能，产生各种效应[9]。TGF-β 发挥作用主要是通过与其靶细胞(主要是成纤维细胞)上的受体结合而激活TGF-β/Smads信号传导通路，使胶原过度沉积导致纤维化的发生发展。相关研究表明Smad3通路抑制剂的表达可以阻断TGF-β信号转导途径，该方法可能为纤维化疾病提供一种新的治疗手段[10～11]。

本实验研究发现，模型组大鼠子宫内膜TGF-β1及Smad3较正常组显著增高(P＜0.05)，中药治疗组、TGF-β1抗体干预组与TGF-β1抗体干预+中药治疗组TGF-β1及Smad3的表达较模型组明显降低(P＜0.05)。Smad3在子宫损伤大鼠子宫内膜中呈高表达，中药治疗组、TGF-β1抗体干预组、TGF-β1抗体干预+中药治疗组子宫内膜组织中的Smad3的表达受抑制，说明TGF-β1/Smad3信号环节是子宫黏连形成的途径之一。中药复方盆舒颗粒、TGF-β1抗体预防宫腔黏连的作用可能是通过抑制这一通路来实现的。

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