慢性阻塞性肺疾病中医证型分布及不同证型间T淋巴细胞亚群指标差异性的研究

刘梅，彭文照，郝小梅

1.广州中医药大学基础医学院，广东 广州 510006；2.广东省第二中医院，广东 广州 510095

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种不完全可逆的，以气流受限为特征的呼吸系统慢性疾病，呈进行性发展，多与肺部对有害颗粒与气体的异常炎症反应有关[1]。研究发现，在COPD的发病机制中，T淋巴细胞表达水平异常、免疫失衡等因素起重要作用。调节性T淋巴细胞(Treg)与辅助性T淋巴细胞(Th)17来源于初始T淋巴细胞，两者在功能和分化过程中相互遏制，在正常机体内，二者保持平衡，共同维持机体免疫平衡[2]。Th22细胞是体内白细胞介素(IL)-22最主要的来源，在机体免疫调节、宿主防御及组织修复中发挥重要作用，固有免疫和获得性免疫淋巴细胞通过生成IL-22作用于细胞来对宿主产生保护作用，参与炎症反应、自身免疫性疾病等的发生、发展[3]。在临床观察中可以发现，中医辨证论治通过调节人体免疫功能、改善临床症状、减慢COPD进程等方面对患者进行综合调治，有积极的临床效果。本研究通过分析COPD患者的中医证型分布情况，及比较不同证型间T淋巴细胞亚群表达变化的差异，对Treg、Th17、Th22在COPD中的作用机制进行初步探讨。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2017年3—7月于广东省第二中医院、广东省中医院呼吸内科门诊和住院治疗的COPD患者，共115例，其中男66例(占57%)，女49例(占43%)，年龄47～91岁，平均67岁；同期体检正常未患COPD者20例，其中男11例(占55%)，女9例(占45%)，年龄52～ 73岁，平均63岁。根据“邪气胜则实，精气夺则虚”，将风寒束肺证、外寒内饮证、痰热壅肺证、痰湿阻肺证设为偏实证组；将脾肺气虚证、肺肾气虚证、肺肾气阴两虚证、气虚血瘀证设为偏虚证组。

1.2 诊断标准 参照《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》[1]中COPD的诊断标准。

1.3 辨证标准 参考《慢性阻塞性肺疾病中医证候诊断标准(2011版)》[4]和《中医内科学》[5]制定中医证候诊断标准观察表，按证候要素综合辨证。

1.3.1 风寒束肺证 咳嗽，喘息，发热，恶寒，无汗，痰白清稀，苔薄，脉浮紧等。

1.3.2 外寒内饮证 咳嗽，喘息，痰多色白，气逆不能平卧，喉中痰鸣，苔白、脉弦紧等。

1.3.3 痰热壅肺证 咳嗽，喘息，胸闷，痰黏多色黄，发热，口渴喜冷饮，舌质红、苔黄腻，脉滑数等。

1.3.4 痰湿阻肺证 咳嗽，喘息，痰多色白，口黏腻，苔白腻、食少纳呆等。

1.3.5 脾肺气虚证 咳嗽，喘息，气短，动则加重，乏力，脘腹胀满，易感冒，便溏，舌体胖大有齿痕、舌质淡，苔白，脉沉细、缓等。

1.3.6 肺肾气虚证 喘息，气短，动则加重，神疲乏力，面目浮肿，易感冒，腰膝酸软，夜尿多，舌体胖大、舌质淡，脉沉细等。

1.3.7 肺肾气阴两虚证 喘息，气短，动则加重，乏力，自汗盗汗，腰膝酸软，耳鸣，易感冒，手足心热，舌质红，脉细数等。

1.3.8 气虚血瘀证 面色紫暗，口唇紫暗，舌有瘀斑，舌下静脉迂曲、粗乱，脉沉涩等。

1.4 纳入标准 符合COPD诊断标准与以上的辨证标准。自愿接受本次研究并签署知情同意书。

1.5 排除标准 不符合诊断标准与辨证标准；由支气管扩张、肺间质纤维化等其他已知病因引起，或具有特征性病理表现的气流受限疾病，如肺囊性纤维化、弥漫性泛细支气管炎；合并非COPD引起的高血压病、糖尿病及其他器官严重病变；不符合纳入标准或临床资料不全等影响辨证者。

2 研究方法

2.1 观察指标 检测Th17细胞分数、Treg细胞分数、Th22细胞分数。

2.1.1 主要试剂及仪器 Ficoll淋巴细胞分离液购自MP Biomedicals公司，1640培养基和PBS液购自Gibco公司，IL-22抗体购自eBioscience公司，其他固定剂、破膜剂、CD3抗体、CD4抗体、CD25抗体、CD127抗体、IL-17A抗体均购自BD Biosciences公司。流式细胞仪，型号BD FACSCanto II，美国BD公司。

2.1.2 检测方法 于清晨抽取受试者空腹静脉血5mL，置于肝素抗凝管中，1 260 r/min，离心5min，取适量血浆于-80℃冻存备用。淋巴细胞分离液分离出外周单核细胞，均分成两部分，一部分行表面染色，避光孵育20min，上机检测Treg细胞分数。另一部分淋巴细胞加入含10%胎牛血清的1640培养液重悬，计数并稀释至(1～2)×107/mL，每孔200μL种板(96孔板)，加入2μL细胞刺激剂混匀。将培养板放入5%CO2、37℃培养箱内培养5～6 h。行细胞表面荧光染色，固定/破膜后再行细胞内染色，设立对照管后上机检测Th17细胞分数、Th22细胞分数。检测要求圈定淋巴细胞为门内细胞，获取10 000个以上门内细胞，并保存相关数据，计算Th17细胞/Treg细胞比值。

2.2 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件进行数据处理。计量资料以(±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 研究结果

3.1 COPD患者中医证候分布情况 风寒束肺证2例，占1.74%；外寒内饮证1例，占0.87%；痰热壅肺证22例，占19.13%；痰湿阻肺证29例，占25.22%；脾肺气虚证21例，占18.26%；肺肾气虚证23例，占20.00%；肺肾气阴两虚证6例，占5.22%；气虚血瘀证11例，占9.57%。

3.2 不同中医证型间T淋巴细胞亚群指标比较 见表1。排除因样本例数太少而无法进一步统计分析的风寒束肺证组和外寒内饮证组。痰热壅肺证组Treg细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数与痰湿阻肺证组相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)；脾肺气虚证组Th17细胞分数、Treg细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数与肺肾气虚证组、肺肾气阴两虚证组、气虚血瘀证组相比，差异均无统计学意义(P＞0.05)。痰湿阻肺证组Th17细胞分数低于痰热壅肺证组，差异有统计学意义(P＜0.05)；脾肺气虚证组、肺肾气虚证组、肺肾气阴两虚证组、气虚血瘀证组的Th17细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数均低于痰热壅肺证组与痰湿阻肺证组(P＜0.05)，Treg细胞分数均高于痰热壅肺证组与痰湿阻肺证组(P＜0.05)。

表1 不同中医证型间T淋巴细胞亚群指标比较(±s)

表1 不同中医证型间T淋巴细胞亚群指标比较(±s)

与痰热壅肺证组比较，①P<0.05；与痰湿阻肺证组比较，②P<0.05

组 别痰热壅肺证组痰湿阻肺证组脾肺气虚证组肺肾气虚证组肺肾气阴两虚证组气虚血瘀证组n 22 29 21 23 6 11 Th17(%)5.65±0.47 4.63±0.34①2.56±0.56①②2.41±0.58①②2.91±0.37①②2.61±0.36①②Treg(%)2.64±0.42 2.55±0.44 5.24±0.54①②5.46±0.68①②5.63±0.35①②5.34±0.57①②Th17/Treg 2.37±0.35 2.34±0.43 0.49±0.13①②0.53±0.11①②0.55±0.21①②0.52±0.23①②Th22(%)2.87±0.63 2.73±0.53 2.11±0.34①②2.15±0.48①②2.22±0.39①②2.01±0.44①②

3.3 偏虚、实证组与对照组T淋巴细胞亚群指标比较 见表2。偏虚证组和偏实证组的Th17细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数均高于对照组(P＜0.05)；偏虚证组Treg细胞分数高于对照组(P＜0.05)，偏实证组Treg细胞分数低于对照组(P＜0.05)；偏虚证组Th17细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数均低于偏实证组(P＜0.05)，Treg细胞分数高于偏实证组(P＜0.05)。

4 讨论

目前，COPD的发病机制尚未完全明了，现认为发病机制包括以下4个方面[6]：①炎症学说；②氧化/抗氧化失衡学说；③蛋白酶/抗蛋白酶失衡学说；④自主神经系统功能紊乱。其中炎症学说占有重要地位。有研究认为COPD以气道、肺实质和肺血管的慢性炎症为特征，在肺的不同部位有肺泡巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞增加，激活的炎症细胞释放多种细胞因子参与COPD的发病[7]。当存在炎症反应或者自身免疫性疾病时，一些细胞因子过度表达会影响初始T淋巴细胞分化，增加Th17分化，导致Treg与Th17失衡，从而引起一系列损害机体的炎症反应[2]。当Th17细胞/Treg细胞比值增大时，提示机体炎症反应状态更为严重[8]。

表2 偏虚、实证组与对照组T淋巴细胞亚群指标比较(±s)

表2 偏虚、实证组与对照组T淋巴细胞亚群指标比较(±s)

与对照组比较，①P<0.05；与偏虚证组比较，②P<0.05

组 别对照组偏虚证组偏实证组n 20 61 54 Th17(%)1.73±0.27 2.92±0.89①4.36±0.75①②Treg(%)4.42±0.71 5.16±1.55①2.77±0.70①②Th17/Treg 0.40±0.08 0.58±0.12①1.69±0.63①②Th22(%)1.30±0.33 2.30±0.42①2.59±0.62①②

《素问》中有“邪气胜则实，精气夺则虚”之说，故本研究在设置偏实证组与偏虚证组时，把外邪胜的风寒束肺证、外寒内饮证、痰热壅肺证、痰湿阻肺证设为偏实证组；将内在正气不足而出现的脾肺气虚证、肺肾气虚证、肺肾气阴两虚证、气虚血瘀证设为偏虚证组。血瘀一证，在平时辨证多认为属实证，但在本试验中考虑患者血瘀皆为老年久病气虚血瘀，实属“本虚标实”，故列入偏虚证组。结果显示：偏实证组痰热壅肺证、痰湿阻肺证所占比例很大，风寒束肺证、外寒内饮证所占比例很小，可能与选取病例集中在3～7月，天气渐暖有关；偏虚证组脾肺气虚证、肺肾气虚证所占比例较大，肺肾气阴两虚证、气虚血瘀证所占比例较小，这也提示了在COPD患者本身病情发展中，以肺气虚为主，气虚与痰饮交织为患，呈进行性发展。

本研究T淋巴细胞亚群检测结果显示，痰湿阻肺证组Th17细胞分数低于痰热壅肺证组(P＜0.05)，提示痰热壅肺证患者的炎症反应程度比痰湿阻肺证患者严重；脾肺气虚证组、肺肾气虚证组、肺肾气阴两虚证组与气虚血瘀证组的Th17细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数均低于痰热壅肺证组与痰湿阻肺证组(P＜0.05)，Treg细胞分数均高于痰热壅肺证组与痰湿阻肺证组(P＜0.05)，提示COPD病情处于偏实证的痰热壅肺证和痰湿阻肺证时，炎症反应与免疫失衡相对加重，促炎症因子Th17所占比例增多，而介导免疫反应的Treg所占比例减少。COPD患者外周血Th17细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数均高于对照组，提示COPD患者持续存在气道慢性炎症；偏实证组Th17细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数均高于偏虚证组，这可能与偏实证组选取病例的中医证候集中在邪气胜的4个证型，此时炎症反应较强有关。偏虚证组Treg细胞分数高于对照组，可能与偏虚证组选取病例多是“精气夺则虚”，正气不足有关。COPD患者持续存在的气道慢性炎症可导致上皮细胞损伤甚至气道重塑，最终导致肺功能损伤，由“邪气胜”的实证向“精气虚”的虚证转变。

综上所述，持续存在的慢性炎症、自身免疫失衡与COPD病情变化密切相关，是导致COPD患者由“邪气胜”的实证向“精气虚”的虚证转变的重要原因，相关T淋巴细胞亚群指标或许可以作为临床中医辨证规范化的部分依据。但本研究样本选择时间段较集中，观察指标数相对较少，Th17细胞分数、Treg细胞分数、Th17细胞/Treg细胞比值、Th22细胞分数在COPD进展中的确切作用机制、与中医证候发展的相关性仍有待进一步研究。

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