孕晚期阴道及肛周拭子不同方法检测B族链球菌和真菌的效果评价及耐药分析*

武爱荣(西安高新医院检验科，西安 710075)

B族链球菌(group Bstreptococcus，GBS)亦称无乳链球菌，是一种β溶血的革兰阳性链球菌，GBS是人类泌尿生殖道和胃肠道的定植菌，一般孕妇的定植率为10%～30%[1]，且定植率随年龄、人种、地域的不同而不同，据报道，我国孕妇定植率为5%～15%[2]。GBS可引起围产期孕妇严重感染，导致胎膜早破、早产、新生儿的宫腔感染和败血症等，严重时危及生命。而真菌作为围产期孕妇的另一种条件致病菌，也会导致胎膜早破和早产等不良妊娠结局。所以，检测孕晚期孕妇生殖道GBS和真菌的定植状况，采取有效的预防和治疗措施是非常有必要的。本文采用血琼脂培养法、显色培养法及PCR法三种方法，分别进行GBS和真菌筛查，并对GBS药物敏感性进行分析，现报告如下。

1材料与方法

1.1 研究对象 选择我院2013年1月～2017年12月产科门诊就诊孕妇22 938例，孕龄35～37周，孕妇年龄21～40岁，平均年龄27.6岁，由接诊医生按规范采集孕妇阴道和肛周拭子，患者或家属立即送检。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 GBS培养鉴定：VITEK2 Compact细菌鉴定仪、GP鉴定卡、哥伦比亚血琼脂培养基、B族链球菌筛查培养基均为梅里埃公司产品。

1.2.2 GBS的药敏定量试验：应用梅里埃VITEK2 Compact鉴定仪、GP67药敏卡，质控菌株：无乳链球菌ATCC12386和金黄色葡萄球菌ATCC25923，均购自中国卫生部临床检验中心。

1.2.3 PCR检测：试剂选用泰普生物有限公司生产的GBS核酸检测试剂盒，GBS核酸检测阴、阳性对照品，均由试剂盒厂家提供；仪器为上海宏石SLAN-48P荧光定量PCR扩增仪。

1.2.4 真菌筛查：哥伦比亚血琼脂培养基、B族链球菌筛查培养基及念珠菌显色培养基均为梅里埃公司产品。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：对孕35～37周的孕妇，参照2002年CDC推荐的方法，进行规范取材。准备两根无菌女性拭子，拿一根棉拭子放入阴道内1/3处，采取阴道分泌物，取材时不需要使用阴道窥器；另一根棉拭子插入肛门至肛门括约肌上2～3 cm处，取直肠分泌物。

1.3.2 GBS筛查方法

1.3.2.1 血琼脂培养法：将采集的拭子立即送到实验室，接种于哥伦比亚血琼脂培养基，放于35℃5 ml/dl CO2培养箱孵育18～36 h，挑取β溶血灰白小菌落，经革兰氏染色镜检为阳性球菌，触酶试验(-)，分纯并做CAMP试验：即将待测菌株与金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC25923)，在羊血培养基上成90°角垂直划线，放于37℃培养箱孵育过夜，如果在金黄色葡萄球菌的β-溶血素与CAMP因子扩散区域出现三角形增强β-溶血区，则该试验为阳性；待次日CAMP试验(+)，用VITEK2 Compact进行鉴定及药敏试验。

1.3.2.2 显色培养法：将采集的拭子尽快运送到实验室，直接接种于显色培养基，放于37℃培养箱孵育18～36 h，挑取红色菌落，做CAMP试验，并分纯培养；待次日CAMP试验(+)，用VITEK2 Compact系统进行鉴定和药敏试验。

1.3.2.3 荧光PCR法：将采集的阴、肛拭子作为一组标本，严格按照GBS核酸检测试剂盒说明书要求进行检测和结果判定。

1.3.3 真菌筛查：将血琼基培养基上灰白卫星样小菌落或灰白小菌落、B族链球菌筛查培养基上呈浅绿色小菌落或灰白小菌落，进行涂片和革兰氏染色，当镜检为真菌孢子时，再接种于念珠菌显色培养基，参照其产品说明书，判断显色结果。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0统计学软件，进行数据分析，计数资料采用阳性率表示，组间差异比较采用多个样本率的χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 三种方法检测GBS的结果比较 见表1。显色培养法筛查GBS阳性率明显高于PCR法和血琼脂培养法，该显色方法检出的263株呈红色菌落，CAMP筛查试验阳性261株，阳性率为99.2%(261/263)，263株经VITEK2 Compact鉴定仪进行菌种鉴定，全部为GBS。三种方法检测GBS比较差异有统计学意义(χ2=94.05，P<0.05)。虽然某些豕链球菌在该显色培养基上也呈现与GBS相同的颜色，但在本研究中还未遇到。

表1 血琼脂培养法、显色培养法和PCR法检测结果比较

2.2 两种培养方法检测真菌的结果比较 22 938例孕妇标本中，6 782例采用血琼脂培养，检出真菌665例(阳性率9.8%)；5 957例采用显色培养基直接培养，检出真菌72例(阳性率1.2%)，两种培养方法对真菌的检出率比较，差异有统计学意义(χ2=429.99，P<0.05)。

2.3 培养法分离出的368例GBS的耐药性分析 对培养法分离出的368例GBS进行药物敏感的MIC值检测，结果见表2。

表2 培养分离出的368例GBS的耐药性分析(n=368)

3讨论

3.1 自20世纪70年代以来，有报道称GBS是侵入性新生儿感染的致病菌，而导致侵入性新生儿感染最重要的危险因素是产妇泌尿生殖道或胃肠道定植的GBS。1996年，美国疾病预防控制中心发布了用于预防新生儿GBS感染的推荐方案，随后，分别在2002年与2010年进行了修订。这些指南的实施，大幅度减少了早发型新生儿GBS感染[1]。但由于很多医院在筛查方法上并没有按照美国推荐的方法统一执行，而且GBS定植率随人种、地域、年龄不同而不同，检出率差异很大。国内有报道妊娠妇女 GBS带菌率为3.5%～32.4%[3]，如厦门地区的14.43%[4]，山东地区的32.2%[5]，北京地区的7.3[6]%，本研究结果显示西安地区妊娠妇女GBS带菌率较低(4.4%)，其中血琼脂培养法和PCR法的阳性率分别为1.5%和2.8%，明显低于显色培养法(4.4%)，这可能与取材、工作人员对该菌的认识、实验操作等有关。虽然PCR法用时短，但对实验室条件要求高、成本高、不易普及，也无法给临床提供药敏结果。而显色培养基是一种含有3种显色底物和抗生素的选择性培养基，标本直接接种，GBS经18～24 h呈典型红色菌落，即可分纯鉴定，该方法检出率高、无需增菌、方便操作，培养出的GBS经分纯后可进行药敏试验，对实验室条件要求不高，有微生物实验室的医院均能开展。因此，显色培养法有望成为妊娠晚期孕妇常规筛查GBS定植的一种准确快速的方法。

3.2 健康妇女泌尿生殖道定植多种微生物，与宿主之间保持微生态平衡。而妊娠期妇女受激素水平的影响，阴道黏膜充血和通透性增加，容易发生感染，有研究表明感染是被公认的重要发病原因[7]。假丝酵母菌为阴道内条件致病菌，能够穿透绒毛膜并侵犯胎儿，导致胎膜早破和早产。杨淑华等[8]报道131例胎膜早破患者中，真菌占生殖道分泌物致病菌的51.1%。虽然国内张利侠等[9]报道真菌对引起胎膜早破并没有统计学意义的结论，这可能与所选人群有关，毕竟引起胎膜早破并不仅仅是这一种感染因素导致的。杨生宇等[10]报道孕晚期筛查真菌对预防胎膜早破、新生儿感染等不良妊娠结局具有非常重要的意义。本研究选用的两种培养法对真菌有一定的检出优势，尤其是血琼脂培养阳性率为9.8%，低于李馨等[11]报道的15.74%。通过本次研究，虽然显色培养法对真菌检出率较低，但如果将两种方法联合使用，同时提高实验室人员对真菌的重视和认识，在提高真菌检出率的同时，可将GBS一并检出，做到早发现、早治疗。

3.3 参照美国疾病预防控制中心(CDC)推荐，把青霉素G和氨苄青霉素作为妊娠晚期GBS的预防性用药，对青霉素过敏的孕妇，可使用红霉素或克林霉素[12]。本研究结果发现，检测368株GBS，对青霉素、氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、利奈唑胺和万古霉素的敏感率均为100%；对红霉素、克林霉素和左氧氟沙星的敏感率分别为17.9%，25.4%和66.7%。与国内相关的研究敏感率一致[5，13]。随着细菌耐药性的改变，尤其是GBS对红霉素类和克林霉素类药物耐药性的不断升高，临床在治疗GBS感染的患者时，应根据药敏结果选择用药。有研究表明[14]，妊娠晚期给予抗生素治疗，不仅可有效减少胎膜早破、早产和新生儿败血症等，还可以提高阴道分娩率，降低剖腹产比例。我院自2013年至今，有一例新生儿是由GBS引起血流感染，但经查询该患儿是从外院转来的，其母亲在我院无产检记录，说明检测孕妇GBS感染状况，及时采取治疗措施，对预防胎膜早破、新生儿感染等不良妊娠结局有重要的临床价值。

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