缺血后适应对心肌缺血再灌注损伤大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶和血小板-白细胞聚集体表达的影响

孙静，任法新，孙晓健，张传焕，李留东，牟楠，董梅

p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是近年来发现的一类新的MAPK通路，是重要的细胞内信号传导酶，在心肌缺血再灌注损伤信号传导通路中发挥重要作用[1]，且p38MAPK与炎性反应调控机制关系密切[2]。血小板-白细胞聚集体（PLA）是反映体内炎症-血栓状态的新指标[3]。本课题组前期已经证实高水平的PLA与急性心肌梗死的发生呈正相关[4]，且能够预测急诊经皮冠状动脉介入治疗（PCI）术后心肌无复流的发生[5]。缺血后适应是防治心肌缺血再灌注损伤的重要措施，能够减少心肌缺血再灌注损伤。缺血后适应保护机制是否与其调控PLA表达和p38MAPK信号通路有关，目前鲜有报道。本研究观察在心肌缺血再灌注损伤中缺血后适应对p38MAPK 蛋白表达及PLA水平的影响，观察其心肌保护作用机制。

1 材料与方法

材料与试剂：健康雄性SPF级SD大鼠60只，购于北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证号 11400700221589。体重 200～250 g。p38MAPK 抑制剂SB203580和激活剂Anisomycin购于德国默克公司。肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒和肌钙蛋白I（TnI）试剂盒购于CUSABIO公司（中国，武汉）。红细胞裂解液购于美国BD Biosciences公司，CD45和CD41a购于美国eBioscience公司。兔抗小鼠磷酸化p38 MAPK多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司，相应二抗购自瑞典Amersham公司。

心肌缺血再灌注模型：大鼠以1% 戊巴比妥钠（0. 23 ml /100 g）行腹腔注射麻醉，颈部正中切口，气管插管后行机械通气。分离右侧颈总动脉，将PE-50聚乙烯管插入颈静脉和颈动脉，手术稳定30 min后，在胸部左侧第4肋间水平打开胸腔， 钝性分离并剪开心包膜，采用6-0丝线阻断左前降支（LAD）30 min 再灌注180 min。在再灌注5 min时，通过右颈静脉根据分组注射不同药物。根据分组给予不同处理。后通过颈动脉插管抽取血3～4 ml，根据所测指标不同给予不同处理。

实验分组：完全随机化方法将实验大鼠随机分为6组（每组10只）。假手术组：开胸，分离左冠状动脉并穿线，但不结扎，旷置30 min，缺血25 min时通过右颈静脉注射10%二甲基亚砜（DMSO）0.8 ml；缺血再灌注（I/R）组：缺血25 min时通过右颈静脉注射10% DMSO 0.8 ml，缺血结束后恢复持续再灌注3 h；缺血后适应组：缺血25 min时通过右颈静脉注射10% DMSO 0.8 ml，缺血结束后、再灌注前通过结夹-松解LAD实现1 min再灌注和1 min缺血反复3次后，持续再灌注3 h；SB203580组：缺血25 min时通过右颈静脉注射SB203580（1 mg/kg，溶于10% DMSO 0.8 ml），缺血结束后持续再灌注3 h；Anisomycin+缺血后适应（Ani+缺血后适应）组：缺血25 min时通过右颈静脉注射Anisomycin（2 mg/kg，溶于10% DMSO 0.8 ml），缺血结束后再灌注前通过结夹-松解LAD实现1 min再灌注和1min缺血反复3次后，持续再灌注3 h；Ani组：缺血25 min时通过右颈静脉注射Anisomycin（2 mg/kg，溶于10% DMSO 0.8 ml），缺血结束后持续再灌注3 h。

心肌损伤标志物的测定：从颈总动脉抽血，3000 g离心15 min后分离上清，留取血清液氮冷冻后-80℃冰箱保存。利用试剂盒测定CK-MB和TnI水平。操作过程严格遵循说明书。

心肌梗死面积测定：再灌注3 h取出心脏置于-20℃冰箱约20 min，冷冻后按垂直于左心室长轴方向切片（厚度约2 mm）。将新鲜组织切片置装有1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（pH 7.4，37℃）中被温孵15 min。TTC染色后，梗死区心肌呈现苍白色，而活性心肌呈现红色。心肌梗死面积以梗死区与总左心室体积的比值来表示。

血小板-白细胞聚集体的测定[6]：在基础状态、缺血30 min、再灌注30 min、60 min及3 h后利用流式细胞仪检测各组PLA水平。取血200 μl，加入柠檬酸钠抗凝，1000 g离心5 min，弃上清，加入6～10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1～2 min，在裂解过程中适当摇动以促进红细胞裂解，1000 g离心5 min，弃上清，如果发现裂解不完全，可以重复上述步骤，加入适量的磷酸缓冲盐溶液（PBS，含 135 mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、1.5 mmol/L KH2PO4和 8 mmol/L K2HPO4，pH7.2），重悬沉淀，1000 g离心3 min，弃上清，加入200 μl 的2%多聚甲醛固定60 min，加入1600 μl PBS静置15min，1500 g离心15 min，PBS重悬3次，最后溶解于200 μl的PBS，每组两管，均加入CD45，对照组一管加入CD41-PE，另一管加入免疫球蛋白（IgG）设为同型对照，暗室30 min后离心，PBS悬浮在FC 500 MPC型流式细胞仪上检测。

蛋白免疫印迹法测定磷酸化p38MAPK水平：再灌注3 h后取出心脏- 80℃冰箱冷冻，提取心肌组织总蛋白，上述蛋白提取液上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，10%分离胶），将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，经封闭、 洗脱后分别加入磷酸化p38MAPK多克隆抗体。抗原抗体复合物用增强化学发光法（ECL）显示，暗室 X光胶片曝光，采用Image-ProPlus图像分析软件分析蛋白条带的积分光密度值（IOD），IOD=平均光密度值×面积，以靶蛋白IOD值/β-肌动蛋白（actin）IOD值的比值反映靶蛋白相对水平。

统计学分析：采用SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用方差分析；均数间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的CK-MB和TnI水平的比较（表1）

I/R组、缺血后适应组、SB203580组、Ani+缺血后适应组和Ani组的CK-MB水平（pg/ml）分别为 637.31±43.99、257.38±53.12、307.18±50.56、500.84±52.93和638.34±25.87。I/R组、缺血后适应组、SB203580组、Ani+缺血后适应组和Ani组TnI水平（pg/ml）分别为 19.67±0.66、10.05±0.81、13.34±0.90、17.32±0.77和19.96±0.72。与I/R组相比，缺血后适应组、SB203580组和Ani+缺血后适应组的CK-MB和TnI水平明显降低（P＜0.05）。与缺血后适应组相比，SB203580组、Ani+缺血后适应组和Ani组的CK-MB和TnI水平明显升高（P＜0.05），Ani组和I/R组之间差异没有统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组的心肌梗死面积比较（表1、图1）

I/R组、缺血后适应组、SB203580组、Ani+缺血后适应组和Ani组梗死面积（%）为40.17±1.77、16.68±2.06、21.38±1.73、27.91±1.79 和40.62±1.59。与I/R组相比，缺血后适应组、SB203580组和Ani+缺血后适应组梗死面积明显降低（P＜0.05）。与缺血后适应组相比，SB203580组、Ani+缺血后适应组和Ani组梗死面积明显升高（P＜0.05），Ani组和I/R组之间差异没有统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I及梗死面积表达（n=10，±s）

表1 各组大鼠肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I及梗死面积表达（n=10，±s）

注：Ani：Anisomycin。与缺血再灌注组相比 P＜0．05；与缺血后适应组相比△P＜0．05

梗死面积(%)假手术组 166．02±33．26*△ 7．79±0．54*△ 0．00±0．00*△缺血再灌注组 637．31±43．99△ 19．67±0．66△ 40．17±1．77△缺血后适应组 257．38±53．12* 10．05±0．81* 16．68±2．06*SB203580 组 307．18±50．56*△ 13．34±0．90*△ 21．38±1．73*△Ani+ 缺血后适应组 500．84±52．93*△ 17．32±0．77*△ 27．91±1．79*△Ani组 638．34±25．87△ 19．96±0．72△ 40．62±1．59△组别 肌酸激酶同工酶(pg/ml)肌钙蛋白I(pg/ml)

图1 各组大鼠心肌梗死面积的比较

2.3 各组血小板-白细胞聚集体表达的比较（表2）

在基础状态、缺血30 min和再灌注30 min时，I/R组与其他各组比较PLA表达水平无差异（P＞0.05）。在再灌注60 min和3 h时，与I/R组相比，缺血后适应组和SB203580组PLA表达水平明显降低（P＜0.05）。与缺血后适应组相比，SB203580组、Ani+缺血后适应组和Ani组PLA表达水平明显升高（P＜0.05）。Ani组与I/R组之间差异没有统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠五个时间点的血浆血小板-白细胞聚集体表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠五个时间点的血浆血小板-白细胞聚集体表达水平比较（±s）

注：Ani：Anisomycin。与缺血再灌注组相比 *P＜0．05；与缺血后适应组相比△P＜0．05

假手术组 (n=10) 7．96±0．30 23．70±2．79*△ 8．99±0．56*△ 8．80±0．36*△ 10．11±0．87*△Ani+ 缺血后适应组 (n=10) 9．30±0．29 22．20±2．82 32．69±2．14 45．26±0．94△ 53．85±1．45△

2.4 各组磷酸化p38MAPK的表达水平比较（图2）

图2 免疫蛋白印迹法分析各组大鼠心肌磷酸化p38MAPK的表达水平

免疫蛋白印迹法检测结果提示，与I/R组相比，缺血后适应组、SB203580组和Ani+缺血后适应组的磷酸化p38MAPK的表达明显降低（P＜0.05），Ani组的磷酸化p38MAPK表达水平明显升高（P＜0.05）。与缺血后适应组相比，Ani+缺血后适应组和Ani组磷酸化p38MAPK表达水平明显升高（P＜0.05）。

3 讨论

既往多项研究证实，缺血后适应能有效地减轻再灌注损伤，炎症机制是再灌注损伤的重要机制之一。本实验通过成功建立大鼠心肌缺血再灌注模型，初步探讨缺血后适应减少心肌缺血再灌注损伤的机制。实验结果提示：（1）心肌缺血再灌注能够抑制p38 MAPK蛋白的磷酸化；（2）PLA在缺血再灌注损伤中发挥重要作用；（3）通过抑制p38 MAPK磷酸化而减少PLA的表达可能是缺血后适应减少缺血再灌注损伤的新机制。

新近研究证实，PLA对于加深对急性心肌梗死发病机制的认识，指导疾病的诊断和治疗，监测疾病本身的进展等方面具有重要临床意义。在临床上，PLA已经成为急性冠状动脉综合征治疗中的新靶点[7]。血小板和白细胞活化后，其表面的黏附分子增加，黏附分子通过配体相互结合和（或）通过纤维蛋白原在黏附分子之间的桥接作用形成PLA。研究表明，PLA可以作为评价血小板活化和炎症反应的指标，是与P-选择素相比，更加敏感的指标[8,9]。炎症反应是心肌缺血再灌注过程中的常见表现[10]，可加重心肌损伤，本实验在缺血再灌注不同时间点观察PLA表达水平，结果提示在大鼠心肌缺血30 min的PLA水平较基础状态明显升高。伴随再灌注时间从30 min～3 h的不断延长，PLA表达水平逐渐升高。由此可见，PLA参与了缺血再灌注损伤过程，并发挥了重要作用。SB203580单独或联合缺血后适应能够显著地降低PLA水平，提示缺血后适应可降低缺血再灌注中的炎症反应，降低PLA水平。

在心肌缺血再灌注时氧自由基和细胞因子的大量释放激活了p38 MAPK，控制多种转录因子的表达活性，但它们激活后是带来了益处还是起到相反的作用尚存在争论。p38MAPK加剧心肌细胞损伤的相关研究表明，心肌缺血时，此信号分子主要通过加重炎症及促进细胞凋亡发挥作用，心肌再灌注后由于氧自由基的大量释放、炎性反应、代谢紊乱等引起心肌新的损伤。心肌缺血和再灌注导致p38MAPK途径的激活，此途径可以使转录因子和胞质蛋白质磷酸化，中性粒细胞和血小板活化增加，加重心肌缺血再灌注损伤。以上提示降低p38MAPK信号途径活性可缓解缺血再灌注损伤，改善心功能。

本实验结果显示在缺血前，各组大鼠p38MAPK水平较低，且各组差异无统计学意义。再灌注后，I/R组和Ani组 p38MAPK的磷酸化水平升高，且再灌注60 min和3 h时，PLA的表达水平明显升高，PLA水平越高，梗死面积越大。SB203580单独或联合缺血后适应使用均有效地抑制了p38MAPK水平的升高，降低PLA水平。说明SB203580可以模拟缺血后适应的心脏保护作用，而p38MAPK激活剂Anisomycin则可部分抵消缺血后适应带来的保护效应；如果单纯给予Anisomycin而不进行缺血后适应干预，则其损伤作用与I/R组类似。这也从侧面证实了缺血再灌注损伤作为一种应激可以激活p38MAPK，进而促进PLA表达水平增加，而缺血后适应则可有效抑制这一过程而减轻缺血再灌注损伤。

综上所述，大鼠心肌缺血再灌注后，PLA表达水平明显升高，p38MAPK 被磷酸化激活，进一步加重了缺血再灌注损伤。给予缺血后适应干预后，心肌磷酸化p38MAPK蛋白的表达降低、PLA水平明显减少，有效地保护了缺血再灌注后的心肌组织，其机制可能与抑制p38MAPK磷酸化有关而减少PLA的表达水平，进而减轻缺血再灌注损伤。

[1]Ono K, Han J. The P38 signal transduction pathway: activation and function[J]. Cell Signal, 2000, 12(1): 1-13. DOI: 10. 1016/S0898-6568(99)00071-6.

[2]Roux PP, Blenis J. ERK and P38MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse biological functions[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2004, 68(2): 320-340. DOI: 10. 1128/MMBR. 68. 2.320-344. 2004.

[3]Schächinger V, Britten MB, Zeiher AM. Prognostic impact of coronary vasodilator dysfunction on adverse long-term outcome of coronary heart disease[J]. Circulation, 2000, 101 (16) : 1899-1906. DOI: 10.1161/01. CIR. 101. 16. 1899.

[4]董海秋, 董梅, 任法新. 血小板-中性粒细胞聚集体在急性 ST 段抬高型心肌梗死患者中表达的研究[J]. 中国循环杂志, 2017, 32(2):145-148. DOI: 10. 3969/j. issn. 1000-3614. 2017. 02. 008.

[5]谭金习, 董梅, 任法新. 术前血小板-白细胞聚集体水平与STEMI患者急诊PCI术后心肌无复流的相关性[J]. 临床心血管病杂志,2016, 32(5): 455-458. DOI: 10. 13201/j. issn. 1001-1439. 2016. 05.006.

[6]高峰, 刘瑞芳, 阎晓琳, 等. 血小板-白细胞聚集体在急性脑梗死患者及其短期预后的水平变化[J]. 国际检验医学杂, 2017, 38(13):1738-1742. DOI: 10. 3969/j. issn. 1673-4130. 2017. 13. 004.

[7]Michelson AD, Furman MI. Laboratory marker of platelet activation and their cilinical significance[J]. Curr Opin Hematol, 1999, 6(5):342-348. DOI: 10. 1097/00062752-199909000-00012.

[8]Klinkhardt U, Harder S. Flow cytometric measurement of plateletleukocyte aggregates: a possible target to monitor platelet function[J].Sem Thromb Hemost, 2005, 31(4): 400-403. DOI: 10. 1016/S0098-1354(00)00609-8.

[9]Michelson AD, Barnard MR, Krueger LA, et al. Circulating monocyteplatelet aggregates are a more sensitive marker of in vivo platelet activation than platelet surface P-selectin[J]. Circulation, 2001,104(13): 1533-1537. DOI: 10. 1161/hc3801. 095588.

[10]陈冰心, 任澎．心肌缺血再灌注损伤信号分子p38MAPK 的研究进展[J]. 心肺血管病杂志, 2010, 29(1) : 68-70. DOI: 10. 3969/j.issn. 1007-5062. 2010. 01. 021.