豌豆根瘤菌高效菌株的筛选

潘亭亭， 王 乐， 姚红丽， 刘忠宽， 曹卫东， 刘朋飞， 刘晓云

(1.河北大学生命科学学院/河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，河北保定 071002；2.河北省农林科学院农业资源环境研究所，河北石家庄 050051； 3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081)

豌豆(PisumsativumL.)多为一年生或多年生的攀缘或矮生草本植物，是家喻户晓的豆类粮食作物，又名蜜豆、青豆等。豌豆因富含蛋白质、脂肪、粗纤维以及维生素B1、维生素B2、维生素C等多种营养成分，具有丰富多样的使用价值[1-2]，其栽培面积和产量仅次于大豆、花生和菜豆[3]。根据联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，简称FAO)统计资料，2005年全世界有88个国家生产干豌豆，栽培面积约为658万hm2，总产量约为 1 126万t[4]。中国是世界上第三大干豌豆生产国和第二大青豌豆生产国，干豌豆生产主要分布在云贵川、江浙、湖北和北方一些省(市)[5]。但是我国与世界豌豆主产国相比，土壤产率较低[2]，如何提高我国豌豆的产量和质量成为当今亟须解决的难题。除选用良种及改进栽培技术是提高豌豆产量的重要途径[6]外，豌豆生产中的肥料合理施用也是比较关键的环节。豌豆可以与相应的根瘤菌形成共生关系从而将空气中的游离态氮固定，满足自身营养所需，所以基本不需要施用氮素或少施氮肥。自然生长的豌豆具有根瘤着生，但其数量有限，而且固氮能力有限。接种适宜的根瘤菌可以大大提高豌豆的结瘤固氮能力，为自身生长提供必需的氮素营养，达到增产的目的[7-9]。豌豆根瘤菌的多样性，为豌豆生产提供了可备选择的根瘤菌资源[10-11]。Palmer等研究表明，可耕种的土壤中的豌豆根瘤菌多样性比草地中的多样性要高[12]。但是，根瘤菌的共生固氮效率既与参与固氮的根瘤菌和植物基因有关，又受到生态环境(如土壤环境与肥力、pH值、温度等)的影响[13]。因此，筛选与植株匹配性较高、能高效固氮的菌株尤为关键。中国科学院南京土壤研究所根瘤菌组等通过豌豆根瘤菌拌种，发现人工接种根瘤菌能够明显改善豌豆的结瘤情况；一些根瘤菌菌株R12、R20、R21、ACCC16101与ACCC16103，可以显著增加豌豆根瘤数量、根生物量及植株地上部分干质量，并获得接种用的菌株[14-16]。张虎天等通过对豌豆-玉米间作体系接种根瘤菌，使土壤含氮量和植株氮素积累量最大，分别增加37.4%和17.4%，并提高了体系中作物根际的细菌数量[17]。本研究以沧州南大港盐碱土为植株主要生长介质，以花叶豌豆为研究对象，旨在筛选出与花叶豌豆高效固氮且耐盐碱的根瘤菌菌株，提高豌豆产量，改善土壤营养状况。

1 材料与方法

1.1 材料

供试土壤为盐碱土，采自河北省沧州市南大港六分区27队，土壤理化性质见表1。

供试作物为花叶豌豆(PisumsativumL.)，由河北省农林科学院农业资源环境研究所刘振宇赠与。供试菌种引自河北大学微生物多样性研究与应用重点实验室，共18株。

YMA固体培养基的配方：K2HPO40.25 g/L，KH2PO40.25 g/L，甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，琼脂粉14 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养 将供试菌种接种在YMA固体培养基上活化，然后将菌种接种到YMA固体斜面培养基上，28 ℃培养3 d，用100 mL无菌水洗下菌体，装进无菌三角瓶中摇床振荡15 min，利用分光光度计测其菌悬液的D600 nm。当D600 nm>0.5后进行接种。

1.2.2 土壤处理 将土壤压碎去杂，按照V土壤∶V沙=4 ∶1，将土壤和沙充分混匀，称取1.0 kg置于种植花盆(20 cm口径)中，种植前适量浇水，使土壤浸润，保持一定湿度。

表1 土壤理化性质

1.2.3 种子处理 挑选饱满未破损的豌豆种子，依次用95%乙醇浸泡5 min，无菌水冲洗5～7次；用浓硫酸浸泡 2 min，无菌水冲洗5～7次；用5%次氯酸钠浸泡5 min，无菌水冲洗5～7次后，将种子均匀放置于装有润湿滤纸的无菌培养皿中，28 ℃避光发芽，每隔12 h换新鲜无菌水，当大部分豌豆芽长到1.5～2.0 cm时，选取萌芽整齐且胚根垂直的种子进行栽培。栽培前，用相应根瘤菌悬液浸泡发芽种子一段时间。

1.2.4 土壤筛选试验 将发芽的豌豆根部朝下，用无菌镊子夹取，植入花盆中，每盆种植5颗，再在豌豆种子处接入根瘤菌菌液2 mL，并用塑料薄膜封闭盆口。每个处理设5个重复，以不接菌作为空白对照。然后将豌豆移置于温室中进行培养，待幼苗长出时，将塑料薄膜划开小口。每隔一段时间浇无菌水1次。待豌豆长出第3张叶时定苗，每盆3株。生育期的管理结合土培试验的要求和豌豆植株生长的需要，在合理的时期搭好支架，防止豌豆倒伏。

1.2.5 收获 待植株生长48 d后进行收获，同时进行结瘤数、株高(从子叶痕处至离生长点最近的展开叶顶端)、地上部分干质量(以第1张叶叶痕处为划分标准，植物样品先在烘箱中于105 ℃杀青2 h，然后于65 ℃烘干至恒质量)、开花结荚情况的统计测定。

1.3 数据处理与统计分析

通过统计软件SPSS 13.0对试验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，在满足方差齐性的情况下，利用Tukey检验进行多重比较，确定各因子水平内部不同水平平均值之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 接种不同根瘤菌对豌豆生长性状的影响

由表2可知，接种根瘤菌菌株对豌豆干质量、结瘤数及株高影响均极显著。由表3可知，接种不同的根瘤菌菌株均对豌豆干质量有影响，在供试的18株菌中，豌豆干质量增幅明显的为Hbu610006、Hbu610015，相比空白对照分别增产82.35%、79.41%，差异达显著水平；接种不同根瘤菌对豌豆结瘤数影响显著，与对照相比，均有不同程度的增加，其中表现较好的有Hbu610005、Hbu610015等8株，分别比对照增加235.77%、231.20%等，与其他多数菌株具有显著差异；对株高影响较大的为Hbu610018、Hbu610002，比空白对照分别增加 16.82%、15.64%，其次为Hbu610006、Hbu610003、Hbu610015、Hbu610007，分别比对照增加15.02%、14.12%、13.75%、13.47%。

2.2 接种不同根瘤菌菌株对豌豆开花、结荚的影响

由表4可知，接种不同的根瘤菌菌株对豌豆开花、结荚的影响不同。与对照相比，接种根瘤菌均在不同程度上增加了豌豆开花、结荚的数量，其中Hbu610006和Hbu6100015表现较好。Hbu610015的平均结荚数为1.1个/株，且42.86%的果荚荚长达到4.0 cm，其花苞数也达到0.8个/株。Hbu610006的果荚大小比较均一，豆荚长大多为2～3 cm，其平均花苞数达到 1.0个/株左右。而且，由表3可知，Hbu610006、Hbu610015的植株干质量增幅明显，Hbu610015的根瘤数比对照明显增加，Hbu610006、Hbu610015的株高仅次于Hbu610018、Hbu610002(除Hbu610003略高于Hbu610015)。可见，植株的开花结荚数与干质量、结瘤数等性状表现一致，可作为筛选高效菌株的辅助参考指标。

表2 不同根瘤菌菌株对豌豆生长性状影响的方差分析

表3 接种不同根瘤菌菌株后地上部分干质量、株高和结瘤数

注：根据Tukey检验，同列数据后不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上差异显著。

表4 接种不同根瘤菌后豌豆开花、结荚的数量

3 结论与讨论

根瘤菌与豆科植物的共生具有宿主多样性与专一性的特点。接种不同的根瘤菌后，与豌豆共生匹配性能较好的菌株，使豌豆在不同的生长性状方面表现出明显的优势。本试验中，接种高效的根瘤菌Hbu610006和Hbu610015后，使豌豆干质量、根瘤数等增加，结荚开花数增多，成熟期提前，最终表现出增产的效果，这与Liu等的研究结果[18]一致。在探究根瘤菌竞争结瘤机制的研究中，肖文丽研究发现，与大豆共生固氮能力较强的菌株4534比共生能力较差的菌株4222产生更多的蛋白响应，这些蛋白主要是代谢相关蛋白、转运蛋白和鞭毛蛋白等[19]。

河北省沧州市属于滨海盐碱地区，可耕种土地极少，大部分为盐碱耕地。据2006年统计[20]，黄骅轻度盐碱耕地 2.46万hm2，占耕地总面积的27.01%，中度盐碱耕地 1.14万hm2，占耕地总面积的12.55%，重度和极度盐碱耕地 5 260 hm2，占耕地总面积的5.77%，其中绝大多数属于中、低产田，若这些土地能被充分利用，将是增加粮食总产量的宝贵土壤资源[21-24]。将根瘤菌接种到花叶豌豆根部，可通过固氮作用为植物提供所需要的氮素。此外，根瘤菌通过分泌有机酸、氨基酸、酶等可增加植物对营养物质的吸收，促进植物生长[25]；通过分泌植物激素、维生素、铁载体等可提高植物的生物量[26]。在本试验中，为充分发挥高效根瘤菌的共生固氮在农业生产实践中的经济价值和生态效益，选择盐碱土种植豌豆，通过豌豆与适宜根瘤菌的相互作用，豌豆植株可获得生长所需的大部分氮素，长势良好，并能增加土壤中根瘤菌及其他微生物的数量，明显改善土壤营养状况。在豌豆根瘤菌对酸碱和盐分的适应性研究中，谢军红等也指出，菌株的盐碱忍耐能力因菌株而异[16]。在花叶豌豆结瘤试验中，发现不同根瘤菌菌株对豌豆的干质量、开花结荚情况影响不同。因此，将豌豆-根瘤菌的共生固氮作用与盐碱土营养匮乏巧妙、有力地结合在一起，能够充分利用前者的优势，改善盐碱土的耕种情况，提高盐碱土的经济价值，为农业生产带来可观收益。

从供试菌株对豌豆生长性状影响的综合指标来看，Hbu610006和Hbu610015的表现优于其他菌株，与供试豌豆品种匹配性较好，可作为与花叶豌豆高效共生的菌株。

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