荧光定量PCR染料法在HLA-B27检测中的应用

富显果,唐宝佳,杨 菁,曹罗元,叶作东,黄宝英*

(1.福建医科大学附属宁德市医院 中心实验室；2.福建医科大学附属宁德市医院 血液风湿科；3.福建医科大学附属宁德市医院 检验科,福建 宁德352100)

人类白细胞抗原B27是6号染色体短臂上的主要组织相容性复合体基因B位点上的第27等位基因的表达产物。既往研究表明 HLA-B27与强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis,AS)之间存在高度的相关性,AS患者中HLA-B27阳性率高达96%以上,而在健康人群中则少于10%[1,2]。AS 是一种常见的侵犯脊柱和骶髂关节的慢性炎症性疾病,具有高度的遗传性,其发病机制尚不明确,至今尚无有效的根治方法。但AS患者如能得及时诊断及合理治疗,可以控制症状并改善预后。目前AS诊断采用1984年修订的纽约标准[3],主要依靠临床表现及腰骶部影像学检查,但AS患者早期临床表现缺乏特异性,当关节出现影像学变化时,病程已非早期,难以很好地指导早期诊断和治疗。因此HLA-B27的检测结合AS患者的临床表现及影像学检查,可实现AS的早期诊断和治疗。

HLA-B27的检测方法主要有两大类：一类是以流式细胞分析法(FCM)为主的抗原检测法,另一类是PCR-SSP法为主的基因检测法,两类方法各有优缺点[4]。目前各大医院多采用流式细胞分析的抗原检测法,但该法由于HLA-B27单克隆抗体与其它B族抗原(主要是B7和B40)存在不同程度交叉反应,可能出现一定的假阳性结果[5]。而常规PCR-SSP法采用等位基因特异性引物PCR扩增HLA-B27基因片段,然后进行凝胶电泳分析,可以准确地检测HLA-B27阳性样本,但该法仍需要进行电泳等PCR后续操作,这既增加了检测时间,也增加了PCR产物交叉污染的可能性。2000年Bon等[6]采用荧光定量PCR法对HLA-B27进行基因分型,该方法在常规PCR-SSP法的基础上,能够对PCR每一循环的荧光强度进行实时检测,无需PCR后续电泳操作,具有简单、准确,快速、检测通量高等优点,并能够实现HLA-B27亚型分析。本文应用荧光定PCR染料法和流式细胞术分析对HLA-B27基因进行筛查,探讨两种方法在HLA-B27检测中的应用价值。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源 收集从2015年4月-2016年12月间来我院就诊的170例临床疑似AS患者,男性113例,女性57例,年龄8-65岁,平均年龄37.1±13.6岁。所有患者抽取 EDTA抗凝外周血2 ml。

1.1.2主要试剂与仪器 Epics XL全自动流式细胞仪(美国Beckman公司)；StepOne Plus 荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；2720型PCR热循环仪(美国ABI公司)；GenoSENS1500凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)；HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体及流式细胞分析相关配套试剂(美国Beckman公司 )；全血DNA提取试剂盒(美国Omega公司)；Taq酶及DNA分子量标准(大连Takara公司)；HLA-B27基因分型测定试剂盒(天津市秀鹏生物技术开发有限公司)。引物由上海生工生物工程有限公司合成,具体引物见表1。

1.2方法

1.2.1流式细胞术检测HLA-B27 将50 μl全血加入测定管中,加入 10 μl免疫荧光标记的单克隆抗体HLA-B27 FITC/ HLA-B7 PE,混匀,室温避光孵育20 min；加入250 μl Optilyse C溶血素,混匀,室温避光 15 min；加入500 μl鞘液,混匀,3 000 r/min离心1 min,弃上清液,重复该步骤,最后加入500 μl鞘液重悬细胞,上机检测。HLA-B27阳性判断标准：HLA-B27 MFI>8.0,且HLA-B27+/HLA-B7-细胞百分比>80%。

1.2.2荧光定量PCR染料法检测HLA-B27表达及亚型 (1)基因组DNA提取：使用OMEGA公司血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA,具体步骤严格按试剂盒说明书进行。(2)HLA-B27表达及亚型检测：具体实验步骤参照HLA-B27基因分型检测试剂盒说明书,基因扩增程序如下：96℃ 2 min,1个循环；96℃ 20sec,68℃ 60sec,5个循环；96℃ 20sec,65℃ 60sec,72℃ 40sec,10个循环；96℃ 20sec,63℃ 50sec,72℃ 45sec,15个循环；72℃ 2 min,1个循环；随后以0.5℃/sec,从55℃到95℃测量SYBR GreenⅠ荧光,从而进行熔点曲线分析。依据八对等位基因特异性引物扩增产物显示的扩增曲线及熔解曲线来进行HLA-B27亚型分析,结果见图1B。

1.2.3HLA-B27基因外显子2、3测序分析 采用等位基因特异性引物扩增HLA-B27基因第2、3外显子。在50 μl PCR反应体系中,基因组DNA100 ng,引物各20pmol、4种dNTP各0.2 mmoL/L,2.5U rTaq酶。96℃预变性2 min后,按下列参数：94℃ 30 s,63℃ 1 min,72℃ 1 min,共30个循环,最后一个循环72℃延伸10 min。PCR产物经胶回收并送上海生工生物工程有限公司进行测序。HLA-B27基因外显子2、3扩增引物及测序引物参照文献[7],见表1。

A：PCR-SSP法扩增HLA-B27基因电泳图 以B*2704为例,泳道3、5、7有特征性扩增产物,泳道8为内参；M：DNA分子量标准(从上至下为：2 000,1 000,750,500,250,100 bp)。B:荧光定量PCR染料法检测HLA-B27亚型特征性熔解曲线图 四条特征性熔解曲线峰从左到右分别对应图2A中3,5,7,8泳道扩增产物,提示为B*2704亚型。

图1荧光定量PCR染料法检测HLA-B27表达及亚型

表1 HLA-B27 外显子2和3扩增和测序引物

1.2.4统计学分析 应用SPSS11.5统计软件包对数据进行χ2 检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1流式细胞术与荧光定量PCR染料法检测HLA-B27结果比较对170例临床疑似AS患者,采用流式细胞分析HLA-B27-FITC/B7-PE双荧光染色法筛查HLA-B27基因,检测出阳性163例；采用荧光定量PCR染料法,检测出阳性158例,其中B*2704 153例(96.8%),B*2705 3例(1.9%),B*2706 2例(1.3%)；两者之间有5例结果不一致,结果见表2。两种方法的符合率为92.9%,经配对χ2检验,两种方法检测差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 流式细胞术与荧光定量PCR染料法检测HLA-B27结果比较

2.2两种检测方法不一致结果分析5例不一致样本,均为流式细胞术检测阳性,而荧光定量PCR染料法为阴性,并提示可能为HLA-B*18、B*40及B*47的亚型。对这5例不一致样本,进一步应用等位基因特异性引物扩增HLA-B27基因第2、3外显子并进行测序分析,结果显示,3例为B*4001与B*5801杂合型,1例为B*4002与B*5801杂合型,1例为B*4001纯合型,见表3。

表3 两种方法检测不一致结果比较

3 讨论

目前,流式细胞分析检测HLA-B27抗原的方法在各大医院中应用,该方法采用荧光素标记的单克隆抗体检测淋巴细胞表面的HLA-B27抗原,具有分析简便、速度快、灵敏等优点,但也存在一些缺点：(1)检测标本需新鲜采集,无法长期保存；(2)HLA-B27单克隆抗体与其它B族抗原B7、B40等交叉反应抗原大家族(CREG)存在不同程度交叉反应,可能出现假阳性结果[5]。虽然本研究采用HLA-B27/ HLA-B7双标记荧光探针检测HLA-B27抗原表达,有效地避免了HLA-B7造成的假阳性结果,但仍无法排除由其它交叉反应抗原家族(CREG)成员的交叉反应。本研究中5例样本为流式细胞分析为阳性结果,而荧光定量PCR法为阴性,经测序分析显示为B*40亚型或B*40与B*58的杂合型。

荧光定量PCR染料法基于聚合酶链式反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)反应原理,引物3'末端的第一个碱基与HLA-B27等位基因特异性碱基互补,特异性引物对仅扩增与其相匹配的HLA-B27等位基因,具有较高的灵敏度和特异性,且无需后续电泳分析,既能节省检测时间,也能有效地避免遗留污染的发生。国内多家医院已将该方法用于HLA-B27基因的检测,与流式细胞分析方法相比,具有较高的符合率[8-10]。本研究结果也显示,两者的检测符合率为92.9%,与国内的报道相一致,同时荧光定量PCR染料法也确认了5例流式细胞假阳性结果,从而提高了HLA-B27检测的准确性。

HLA-B27 基因与AS 之间存在非常强的关联性,AS患者中HLA-B27阳性率高达96%以上,而在健康人群中则少于10%[1,2]。目前,依据IMGA/HLA Database Release HLA-B27等位基因数据库,B27多态性已达到156种之多,针对B27 基因多态性与AS 的相关性也进行了大量的研究显示,不同地区、民族和人种之间HLA-B27 亚型与AS的关联是有区别的,其中,白种人与B2702和B2705相关,其中B2705亚型占绝大多数；而在中国汉族人群中,B2704和B2705构成了B27的优势亚型,另外还检出少数的B2702、B2703、B2707、B2708、B2711、B2713、B2715和B2722等亚型[11,12]。同时,不同地区汉族人群的AS患者分布以及在诱发AS 的发病风险方面也是存在地域差异,B*2704 与AS 的相关性要强于B* 2705[12]；而也有学者指出北方汉族与上海、广东、台湾地区AS 患者中B27 基因多态性的分布有较大差异,其中B*2705差异最显著[13]。本研究采用多对等位基因特异性引物的荧光定量PCR染料法对158例AS相关HLA-B27阳性患者进行亚型分析,结果显示：B*2704为主要亚型,占96.8%,其次为B*2705,占1.9%,另有2例为B*2706,占1.3%,这说明B*2704在AS的发病中起主导作用,这与该结果与国内汉族其他地区的研究基本一致[14-16]。因此,采用该荧光定量PCR染料法,可克服流式细胞分析无法鉴定亚型的缺点,可为AS的诊断和治疗提供更为可靠的辅助诊断依据,并为深入探讨HLA-B27在AS发病中的作用提供依据。

综上所述,荧光定量PCR染料法可有效提高HLA-B27检测的准确性,并能够实现HLA-B27亚型分析,从而可为AS的早期诊断和治疗提供可靠的辅助诊断依据。

作者简介：富显果(1979-),男,副主任技师,医学博士,主要从事免疫和分子生物学检验及研究。

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