类火星环境的低气压和水对发状念珠藻复苏的影响

褚亚东，刘颖慧，陆洪斌，曹旭鹏，薛 松

（中国科学院大连化学物理研究所海洋生物工程组，大连116023）

1 引言

火星表面的大气压平均为600 Pa，是地球气压的0.5%；火星表面的温度变化范围为－143℃～35℃，火星大气的主要成分是CO2，占火星大气的96%；其次是N2，占1.89%；H2O 含量较低，仅占0.03%［1］。火星目前不是一个生命宜居星球，但火星的资源开发利用和环境改造，可使火星形成类地球环境。目前，NASA科学家于2010年前后提出并被大家所接受的火星移居改造需要经过“加热、加气、种树、种地、生产、盖房、搬家”七个阶段和步骤。在种树阶段，人类可以将某些极端微生物和微藻、苔藓带到火星上繁衍［2］。

微藻是空间站中被广泛深入研究的生物之一，其目的是作为生产者循环利用系统内的氮、水、CO2等以制取有机物和氧气，提供给空间站的人［3⁃5］。 公开报道中，欧美国家合作在国际空间站进行了为期16个月的存活培养测试，最终获得的两株微藻，其中有一株为蓝藻念珠藻，另一株为绿藻［6］。

发状念珠藻（Nostoc flagelliforme），在中国又名“发菜”，是一种陆生蓝藻，生长在干旱、半干旱地区，具有极强的耐旱性、耐变温、耐太阳辐射、耐盐碱和耐贫瘠等生理学特性［7⁃9］。 此外，发菜对生存环境的选择性很强，干⁃湿交替的微环境是其生长发育的必要条件［10］。本实验室前期研究发现发菜在低气压（100 Pa、600 Pa、1200 Pa）的长期冷热频繁交替条件下仍可以维持生命活动，具有在类火星表面长期生存的可能性［11］。此外，发菜不仅可以改良荒漠化土壤［7］，且营养丰富，含蛋白质20% ～23%，碳水化合物为57%，粗脂肪为5.6% ～5.7%，其中人体必需的7种氨基酸占总量的35.83%，尤其亮氨酸、苏氨酸、精氨酸和缬氨酸最为丰富，还可食用，有望成为改造类火星环境“先锋植物”的首选［12⁃13］。 然而，目前并没有从改造类火星环境等方面对微藻在类火星的生存条件和可控培养进行研究和探索。

因此，本文拟通过在室内搭建一套在线监测模拟类火星环境密闭体系内发菜复苏时放氧速率的试验装置，考察不同温度下气压低于和高于相应的水饱和蒸气压时对发菜光合放氧的影响，为微藻改造类火星环境的应用奠定基础。

2 材料和方法

2.1 试验材料

发菜采自内蒙古阿拉善盟，试验前已干燥存储2年。

2.2 发菜复苏监测放氧装置的搭建

本文拟考察发菜在类火星表面半开放体系复苏的可行性，希望检测出发菜在模拟火星气压组成，接近火星气压（600 Pa）条件下，发菜光合恢复的极限条件。因此，在试验设计的时候我们首先考虑的是最低限度保障发菜能够有活性，即发菜复苏的标准定义为发菜放氧速率达到发菜在正常状态的1%，即4μmol O2·h－1·g－1（DW） 。

为了模拟类火星环境低气压，我们设计了如图1所示的试验装置原理图。本系统中使用绝对压力传感器替代普通真空压力表，使压力显示更准确，同时可以用于系统内各管路部分体积的标定，附以气相色谱仪使氧气浓度的计算更准确。

图1 发菜复苏监测放氧装置原理图Fig.1 Schematic diagram of the on⁃line O2 evolution monitoring system for N.flagelliforme recov⁃ery

通过选用高真空玻璃管，搭建成图2所示的发菜复苏监测放氧装置，通过调节阀门，在真空泵的抽气作用下将发菜培养罐内气体置换为模拟气，并可以将气压控制在接近火星的气压；真空泵可以通过调节阀门将取样环气体抽出使其接近真空，再调节三通阀，可将发菜培养罐内气体吸至取样环内，再调节阀门，由载气带入气相色谱进行检测。

2.3 发菜复苏培养条件

图2 发菜复苏监测放氧装置图Fig.2 Set⁃up of the on⁃line O2 evolution monitoring system for N.flagelliforme recovery

发菜生长于干旱、半干旱地区，水分是其生长的主要限制因子。自然条件下，雨水、露水和雾气是其生长所需水分的主要来源，环境水分条件是发菜生存生长的关键性因子［10］。干燥发菜能从相对湿度高于28.4%的环境空气中吸取水分。而火星环境中气压为 600 Pa，气态水也不足0.03%。因此，为了考察发菜复苏时所需最低气态水，我们在选择气压的时候将在不同温度条件下气压和蒸气压对应，目的是希望检测发菜在接近火星低气压条件下，发菜复苏的极限条件，而本试验设计的难度在于很难稳定控制体系内的低气压。具体培养方法见下：

称取1 g发菜，用去离子水清洗3至4次，放在液体BG11 培养基，25℃、40 μmol photons·m－2·s－1下培养24 h。培养好后，将发菜用滤纸吸干放在图2装置中的发菜培养罐中，温度通过循环水浴分别设定为5℃、15℃、25℃。光照采用LED光源模拟火星光照环境（由于LED光源亮度易于控制光照从无到有再到不同光强的正弦波变化），光照阶段光强以地球地表光强40%（即800 μmol photons·m－2·s－1）为上限呈正弦波变化，光暗比14 h∶10 h。将气体置换为CO2和N2（体积比为95∶5），通过真空泵抽取真空达到测试压力，压力设定依据所对应的水饱和蒸汽压，如5℃的水饱和蒸汽压为0.87 kPa，15℃的水饱和蒸汽压为1.70 kPa，25℃的水饱和蒸汽压为3.17 kPa。气态水状态时，气压低于相应温度的水饱和蒸气压，而液态水状态时高于相应的水饱和蒸气压，具体参数设定见表1。每个试验条件做了两个独立的重复。

此外，为了验证含水量是否是影响发菜在类火星环境中的重要影响因素，在5℃、气压为1.0 kPa以上为液态水状态下，在发菜培养罐中分别加入5 mL和10 mL BG11液态培养基进行试验。

表1 不同温度下水分状态对发菜复苏影响试验设计Table 1 The experiment design of N.flagelliforme re⁃covery under different water and temperature conditions

2.4 光合放氧速率测定

具体低压状态下发菜放氧速率测定方法如下：首先设定循环水浴为试验温度，然后打开真空泵，使除培养罐及载气和气相部分以外的系统处于真空状态，再将预先复苏的发菜放入培养罐中，封闭培养罐。将模拟气源连接至入气口处，使发菜培养罐与模拟气源连通，然后再调节阀门使真空泵与培养罐连通，将培养罐气氛置换为模拟气。再次调节阀门，使培养罐与模拟气源断开，并控制培养罐达到所需气压，然后打开LED光源。对于放氧量的测定，以空气为对照气。在测定放氧时调节取样三通阀，先将取样环与真空管路连通，抽真空后再旋转三通阀与培养系统连通，取样。然后旋转三通阀将取样环隔离，旋转进样四通阀，使进样环与载气管路串联，进入气相色谱。

在进行放氧量测定的过程中，需要先测定气相色谱峰面积与氧气摩尔量的关系，如式（1）、（2）所示［14］：

式中，Va为标准空气的进样体积，单位L；q为空气中氧气百分比，取20.947%；S为标准空气氧气峰面积，单位mV·s；Vmol为单位摩尔气体体积，单位L；Mo为单位峰面积对应的氧气摩尔量，单位mol；Ta为环境温度，单位℃。当已知培养系统容积时，可测得系统内总氧气摩尔量，如式（3）所示：

式中，Ot为系统内总氧气摩尔量；As为样品气氧气峰面积；Vt为系统总容积；Vs为进样环体积。

通过氮气色谱峰的增量与空气中氮气峰氧气峰的峰面积比值可以计算得出渗入系统内的氧气所占的峰面积，如式（4）所示：

式中，Sod为渗入系统的空气引起的氧气峰面积增量；Snd为渗入系统的空气引起的氮气峰面积增量；So为参比空气中氧气峰面积；Sn为参比空气中氮气峰面积。

结合式（3）、（4），系统内发菜释放的氧气摩尔量计算如式（5）所示：

式中，Or为发菜释放的氧气摩尔量。

3 结果和讨论

3.1 不同温度和气压下水分状态对发菜光合放氧影响

水分是发菜生理活性的重要限制因子，适宜的水分有助于发菜维持正常的生理代谢和生长［15⁃16］。 依据表1的温度和气压设定，分别考察5℃、15℃、和25℃低于和高于相应温度的水饱和蒸气压时对发菜光合放氧的影响。

3.1.1 25℃不同气压下发菜光合放氧

图3显示的是25℃下气态水和液态水对发菜光合放氧的影响。从图3B中可以看到在反应器温度为 25℃，气压为3.9～4.2 kPa变化范围内，为液态水状态时，发菜放氧速率最高时为10 μmol O2·h－1·g－1（DW），是发菜在正常放氧速率（400 μmol O2·h－1·g－1（DW））的 3%。 但发菜放氧速率随着反应时间的延长呈现出先上升后下降再上升的趋势，这与毕永红等（2003年）报道一致［16⁃17］。

为了考察气态水对发菜光合放氧的影响，将气压调至2.5 kPa（图3 A）。在最初反应3 h内，气压低于3.5 kPa，体系内为气态水，放氧速率最高为 7 μmol O2·h－1·g－1（DW）。 由于体系存在水分，水分气化，很难维持在2.5 kPa，在反应大约3 h 气压上升，维持在3.5 ～4.3 kPa，放氧速率呈现下降的趋势，但是在反应25 h有所上升，此时放氧速率为2.5 μmol O2·h－1·g－1（DW）。通过比较可以得出，在25℃、液态水状态下，发菜光合放氧能力比在气态水状态下更高，这验证了我们所推测的，在火星环境中，发菜生存的关键因素是水分。

图3 25℃不同状态水对发菜光合放氧的影响Fig.3 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 25℃

3.1.2 15℃不同气压下发菜光合放氧

图4显示的是15℃下不同状态水对发菜光合放氧的影响。在15℃，气压为3.0～4.9 kPa（图4B），此时水的状态为液态水，发菜放氧速率最高时为 7 μmol O2·h－1·g－1（DW），比 25℃条件减少了约30%。随着反应时间的延长，与25℃液态水条件类似，放氧速率呈现出先下降后上升再下降趋势。当将气压调至1.5 kPa，但是由于体系内在原因导致的压力变化，气压在1.8 kPa左右，反应 1 h，放氧速率为 4.7 μmol O2·h－1·g－1（DW），随着反应时间的延长，反应4 h后发菜几乎是完全干燥状态，没有水分，此时检测不到放氧速率。这可能是由于发菜水分完全丧失时，光合作用的终止导致［12］。但是，反应26 h后，放氧速率有所上升，为2.9 μmol O2·h－1·g－1（DW），但是，导致这一现象的原因并不是很清楚。通过比较可以得出，在15℃、液态水状态下，发菜光合放氧能力比在气态水状态下更高。

3.1.3 5℃不同气压下发菜光合放氧

图4 15℃不同状态水对发菜光合放氧的影响Fig.4 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 15℃

当反应器温度为 5℃，气压维持在 1.4～1.6 kPa，为液态水状态时，发菜放氧的最大速率为5 μmol O2·h－1·g－1（DW）（图 5 B），与 25℃ 和15℃液态水条件类似，放氧速率呈现出先下降后上升再下降趋势。当气压调至0.9～1.0 kPa，为气态水状态时（图5 A），发菜的最高放氧速率为3 μmol O2·h－1·g－1（DW），反应 1 h，放氧速率为3 μmol O2·h－1·g－1（DW），反应 3 h 后，反应器内无液态水时，检测不到放氧。随着反应时间的延长放氧能力有所恢复，但是29 h后发菜又失去放氧能力。从以上数据推测，如果继续将温度降低到0℃时，发菜将不会有放氧，因此，本试验没有设计做0℃以下的试验。

将5℃、15℃和25℃不同气压条件下发菜光合放氧最大放氧速率和平均放氧速率总结至表2中。从表2数据中可以看出，当发菜在气压低于相应温度蒸气压下即没有液态水的情况下，放氧能力下降，必需有少量液态水，且随着温度下降，放氧速率也会下降。本试验中，发菜复苏标准定义为发菜光合放氧速率达到发菜在正常状态的 1% ，即 4 μmol O2·h－1·g－1（DW）。 因此，本试验中发菜复苏的极限条件是5℃、1.4 kPa。

图5 5℃不同状态水对发菜光合放氧的影响Fig.5 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

表2 不同温度和气压下水分状态对发菜光合放氧影响Table 2 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at dif⁃ferent temperatures

3.2 不同含水量对发菜光合放氧影响

李运广等报道发菜生长于干旱、半干旱地区，水分是其生长的主要限制因子［15］。为了确定在模拟火星条件下含水量对发菜光合放氧能力的影响关系，我们在最低温度5℃条件下加入不同体积的BG11液体培养基（图6）。在5℃、气压为1.7 ～1.9 kPa（水的状态为液态水），加入 5 mL⁃BG11液体培养基，可以看到放氧速率最高值上升至7 μmol O2·h－1·g－1（DW）（图 6A）；而当加入10 mL BG11液态培养基时，发菜的最大放氧速率上调至 12 μmol O2·h－1·g－1（DW），甚至超过了25℃液态水条件下最高速率 10 μmol O2·h－1·g－1（DW）（图6B、表2）；此外，发菜复苏过程中加入水分，整个复苏过程（31 h），发菜保持着放氧能力。这个结果说明在类火星环境下水对发菜复苏的影响很大。

图6 5℃不同含水量对发菜光合放氧的影响Fig.6 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

3.3 类火星环境下气压、水、温度对发菜光合放氧复苏影响力比较

发菜在野外生长地年最高气温可达39.1℃，最低低温可达－28.0℃，变幅为67.1℃。在这种气温幅度中，地表最高气温可达65.7℃，地表最低温度达－29.1℃，实际上发菜所能忍受的温度差值达到94.8℃［9］。 因此温度不是发菜生长的限制因素。此外，本试验室前期结果显示在－20℃下，100 Pa、600 Pa、1200 Pa处理60 天后，发菜能够在BG11培养基中恢复放氧［11］，这些结果已经说明低温和低气压不是限制发菜复苏的因素。地球上的生物进化到可以耐受高气压环境如深海环境，但是由于地球环境因素没有类似于火星环境中的低气压，目前几乎没有关于生物对于低气压环境适应机制的研究［18］。

综合5℃条件下水的不同状态及含有液态水下发菜的放氧速率（表3），可以看到液态水是影响发菜复苏的重要决定性因素，温度和气压不是最大限制性因素。

表3 5℃下不同含水量对发菜光合放氧影响Table 3 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

4 结论

1）通过选用高真空玻璃阀门组件，使发菜在长时间存放后仍保持气压及气体组成为所需状态，成功搭建了在线监测发菜复苏放氧装置。

2）检测显示5℃、15℃和25℃在高于和低于相应水饱和蒸气压条件下，发菜光合放氧最大放氧速率分别为5、7 和10 μmol O2·h－1·g－1（DW），和1、2 和3 μmol O2·h－1·g－1（DW），验证了试验最初的设想，发菜在类火星条件下可以复苏；而在5℃，低于水饱和蒸气压时，加入10 mL BG11时，发菜放氧速率最高上调至 12 μmol O2·h－1·g－1（DW），这说明水对发菜在类火星表面半开放体系复苏的影响大于气压。

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