PPP2R2A在乳腺癌细胞中结合GFPT2并导致其去磷酸化

李笑荣，张进，马端

复旦大学 基础医学院，上海 200012

PP2A是一种重要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，是由调节亚基 (B)、支架亚基 (A) 和催化亚基(C) 组成的异三聚体，其中调节亚基B决定PP2A磷酸酶复合物的底物特异性和亚细胞定位[1-2]。目前在人类细胞中共发现有12种PP2A调节亚基，PPP2R2A是PP2A中调节亚基之一[3]。以往的研究表明，PPP2R2A参与肿瘤的发生发展，促肿瘤细胞生长[4-7]。例如，胰腺癌细胞中 PPP2R2A的表达显著增加，可激活多条促肿瘤发生的信号通路 (AKT-，ERK-，Wnt-)[8]；肿瘤细胞中的PPP2R2A/PP2A可催化将c-Jun的T239位点去磷酸化，促进其与 DNA结合从而促进细胞的增殖和迁移[4]；此外，肿瘤组织谷氨酰胺的缺乏可诱导PPP2R2A表达的上调，并抑制P53通路，从而促进肿瘤细胞生存[9]。

本课题组前期研究也发现，在乳腺癌细胞中下调PPP2R2A后，细胞增殖和迁移的能力显著下降。由于PPP2R2A是磷酸酶复合物的调节亚基，决定了PPP2R2A-PP2A磷酸酶复合物的底物特异性，因此寻找PPP2R2A的相互作用蛋白质，有助于阐明 PPP2R2A的作用机制。本研究通过SBP-HIS8串联纯化分离了PPP2R2A蛋白复合物，进而通过 HPLC-Chip-ESI/MS/MS分析其蛋白组分。蛋白质质谱结果显示 PPP2R2A与 GFPT1/GFPT2结合。GFPT1/GFPT2是己糖胺途径的限速酶，催化谷氨酰胺水解为谷氨酸，6-磷酸-果糖转化为 6-磷酸-葡萄糖胺。然后经一系列反应产生UDP-GlcNAC，而UDP-GlcNAC是蛋白质O-连接丝氨酸-苏氨酸的糖基化修饰以及糖原、糖脂修饰的糖基供体[10-11]。在本研究中，我们将进一步确认 PPP2R2A与 GFPT1/2间的相互作用，以及对GFPT1/2磷酸化和下游蛋白糖基化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人胚肾细胞株HEK293T、HEK293和人乳腺癌细胞 MDA-MB-231购自 ATCC；大肠杆菌DH5α由本实验室扩增提供；慢病毒包装用辅助质粒 (TAT/GAG/VSVG/REC) 购自 SBI公司；Streptavidin-beads购自 GE公司；Protein A/G beads购自 Roche公司；GST beads购自 Sigma公司；单克隆兔源抗 PPP2R2A抗体和单克隆兔源抗GAPDH抗体购自Bioworld公司；单克隆鼠源FLAG抗体购自Abmart；单克隆鼠源 GST抗体和单克隆兔源HA抗体购自Sigma 公司；兔源PKA substrate购自CST公司；Dylight 488以及Dylight 594购于Jackson Immuno Research。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒构建

构建 PCDH-FLAG3-HIS8-SBP-Puro重组质粒，首先设计SBP引物，并添加连续编码8个HIS氨基酸序列标，PCR扩增得到目的片段，纯化后酶切，与酶切处理的PCDH-FLAG3-Puro质粒进行连接，质粒经转化，然后菌落经PCR鉴定扩大培养阳性克隆。最后重组质粒测序鉴定。重组质粒PCDH-FLAG3-hyg-GFPT1/PCDH-FLAG3-hyg-GFPT 2/PCDH-FLAG3-HIS8-SBP-PPP2R2A-Puro/mGSTHIS-GFPT1/mGST-HIS-GFPT2/PCDH-FLAG3-hyg-PP P2R2A以及mGST-HIS-PPP2R2A构建方法同上，其中引物如表1所示。

表1 引物名称和序列Table 1 Primer names and sequences

1.2.2 细胞稳转株构建

以HEK293T为慢病毒包装细胞，按照说明，将4种辅助质粒按照和基因表达质粒等比例混合即 Rec∶VsVg∶GAG∶TAT∶目标质粒=1∶1∶1∶1∶4，脂质体 Lipofectamine介导转染，24 h后收集病毒上清，2 000 r/min离心，上清中含有组装好的慢病毒加入细胞中，同时加入2.5 ng/mL 聚凝胺 (Polybrene) 促进感染，同上分别收集 48 h以及72 h的病毒并感染细胞。最后一次病毒感染48 h后，使用潮霉素加压筛选细胞稳转株。

1.2.3 串联亲和纯化联合HPLC-Chip-ESI/MS/MS分析

收集稳定表达 SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A的细胞稳转株MDA-MB-231，加入15 mL细胞裂解液 (含1% Triton X-100，1 mol/L巯基乙醇) 冰上裂解20 min，离心收集全部细胞上清。第一次链霉柔和素 (Streptavidin) 纯化，蛋白上清加入Streptavidin磁珠，4 ℃过夜；弃上清，用细胞裂解液 (含0.1% Triton X-100，1 mol/L巯基乙醇) 洗涤5遍，每次3 min，最后保留1 mL左右含有沉淀复合物混悬液，加入400 μL 生物素洗脱液 (无EDTA/EGTA，含2 mmol/L biotin，20 mmol/L 咪唑)，4 ℃旋转4 h后，收集上清。第二次Ni磁珠纯化，蛋白上清加入40 μL PBS平衡后的Ni磁珠，4 ℃旋转2 h；离心弃上清，加入0.05 mmol/L的NH4HCO3(pH 8.0)，4 ℃ 静置5 min，离心弃上清，重复2次；加入10 mmol/L的NH4HCO3，用2 μg胰酶酶切过夜，取出酶切产物，2 000 r/min离心1 min (4 ℃)，收集上清加入2 μg胰酶继续上述酶切4 h (37 ℃)，2 000 r/min离心1 min，收集上清。最后HPLC- Chip-ESI/MS/MS分析，上清样品经过色谱分离后，肽段先后进入一级质谱和二级质谱，从而进行分析和鉴定。

1.2.4 细胞免疫荧光

将高压灭菌的盖玻片蘸于 0.1%明胶中后放至12孔板中；HA-PPP2R2A和PCDH-hyg-FLAGGFPT1/2重组质粒依据产品说明书进行脂质体Lipofectamine@2000瞬时转染，转染6 h后消化细胞，将其接种在明胶上生长，24 h后用4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBST (0.2% Triton X-100)洗涤3次，5 min/次，3% BSA封闭1 h；取出玻片加入兔源抗HA一抗和鼠源抗FLAG一抗混合液 (1∶100)，湿盒中4 ℃过夜；PBST (0.2% Triton X-100) 洗涤3次，5 min/次，再加入Dylight 488标记羊抗鼠IgG荧光二抗以及Dylight 594标记羊抗兔 IgG 荧光二抗的混合液 (1∶10)，室温孵育1 h，需避光；PBST (0.2% Triton X-100) 洗涤3次，5 min/次，DAPI染细胞核，避光静置5 min；封片并荧光显微镜下观察。

1.2.5 GST Pull-down

PCDH-hyg-FLAG-GFPT1和mGST-HIS-PPP2R2A重组质粒依据产品说明书进行脂质体Lipofectamine@2000瞬时转染，24 h后收集细胞抽提蛋白；蛋白上清分成2份，一份取50 μL用作input，剩余的细胞裂解液全部用于GST Pull-down，按每个蛋白样品需要20 μL GST磁珠，取适量的磁珠用细胞裂解液清洗3次，将GST磁珠加入待测样品中，4 ℃旋转孵育过夜；次日，小于500×g离心2 min，弃上清，细胞裂解液清洗磁珠 3次，磁珠沉淀加入50 μL 的 SDS 上样缓冲液，95–100 ℃ 变性 5 min，12 000 r/min离心5 min；Western blotting检测目的蛋白。

1.2.6 免疫共沉淀 (Co-IP)

PCDH-hyg-FLAG-PPP2R2A和mGST-GFPT1/2重组质粒依据产品说明书进行脂质体 Lipofectamine@2000瞬时转染；24 h后收集细胞抽提蛋白，一份取50 μL用作input，剩余的全部用于免疫共沉淀；按每个样品30 μL×2磁珠，取适量的蛋白A/G，用细胞裂解液清洗3次；蛋白样品与30 μL蛋白A/G混匀，4 ℃旋转孵育 1 h；小于 500×g离心2 min，弃沉淀，上清加入鼠源FLAG (2 μg) 抗体，4 ℃ 旋转孵育 1 h，再加 30 μL Protein A/G，4 ℃旋转孵育过夜。次日，小于500×g离心2 min，弃上清。用细胞裂解液洗磁珠3次，磁珠沉淀加入50 μL 的SDS 上样缓冲液中，95–100 ℃变性 5 min，12 000 r/min 离心5 min；Western blotting检测目的蛋白。

2 结果与分析

2.1 串联亲和法联合HPLC-Chip-ESI/MS/MS分析筛选出PPP2R2A结合蛋白GFPT1/2

通过慢病毒感染建立SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A稳定表达的 MDA-MB-231乳腺癌细胞，Western blotting检测PPP2R2A表达结果显示，除了内源性的PPP2R2A条带外，在稳转细胞内还有因加入纯化标签而变大的 SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A条带，与内源性PPP2R2A表达水平相当 (图1)。先通过SBP-HIS8串联纯化分离PPP2R2A蛋白复合物，进而通过 HPLC-Chip-ESI/MS/MS鉴定与PPP2R2A相互作用的蛋白。蛋白质质谱鉴定结果显示，除了PPP2R2A蛋白外，还有PP2A复合物蛋白PPP2R1A和PPP2CA，这表明了该方法的可靠性。在被鉴定的蛋白中，GFPT1和GFPT2同属于 L-谷氨酰胺-D-果糖-6-磷酸转氨酶，并且均有多个肽段被鉴定 (表 2)，因此我们将进一步分析PPP2R2A与GFPT1/2间的相互作用。

2.2 PPP2R2A蛋白与GFPT1/2蛋白相互作用的确认

在 HEK293T细胞中，重组质粒共瞬时转染PCDH-hyg-FLAG-GFPT1/2和mGST-HIS-PPP2R2A，设置瞬转PCDH-hyg-FLAG空载和mGST-HIS空载作为阴性对照。GST Pull-down结果显示PPP2R2A可沉淀细胞中的 FLAG-GFPT1和 FLAG-GFPT-2(图 2A、B)；反向，使用 FLAG抗体通过 Co-IP分别沉淀FLAG-GFPT1和 FLAG-GFPT2融合蛋白，结果同样表明二者均可沉淀细胞中的PPP2R2A蛋白。进一步说明PPP2R2A与GFPT1/2存在相互作用。

图1 Western blotting检测SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A稳定细胞株的PPP2R2A表达水平Fig. 1 Detection of the expression of PPP2R2A in the stable MDA-MB-231 cells of SBP-HIS-FLAG-PPP2R2A by using Western blotting.

表2 串联亲和法联合 HPLC-Chip-ESI/MS/MS结果显示GFPT1/2是PPP2R2A潜在的结合蛋白Table 2 The results of tandem affinity and HPLCChip-ESI/MS/MS identified the GFPT1/2 as the potential partner of PPP2R2A

图2 PPP2R2A蛋白与GFPT1/2蛋白相互作用Fig. 2 The interaction between PPP2R2A and GFPT1/2 was further validated. (A, B) GST Pull-down of PPP2R2A with Flag-GFPT1/2. HEK-293T cells were co-transfected with plasmids expressing GST-tagged PPP2R2A (or empty vector) and Flag-tagged GFPT-1/-2. PPP2R2A was precipitated with GST Pull-down, and the pull-down products were analyzed by anti-Flag immunoblotting. (C) Co-immunoprecipitation (IP) of PPP2R2A with Flag-tagged GFPT1/2.PPP2R2A was immunoprecipitated with an anti-Flag antibody, and co-immunoprecipitated PPP2R2A was analyzed by anti-GST immunoblotting.

2.3 PPP2R2A蛋白与GFPT1/2蛋白在细胞内共定位

在HEK 293细胞中，共同转染HA-PPP2R2A和FLAG-GFPT1/2表达质粒，用鼠源抗FLAG和兔源抗HA抗体做免疫荧光检测，结果如图3A、B显示，PPP2R2A与GFPT1/2在细胞中共定位于细胞质中。

图3 PPP2R2A与GFPT1/2在细胞质中共定位的免疫荧光结果Fig. 3 Colocalization of PPP2R2A and GFPT1/2 in cytoplasm. (A, B) GFPT1/2 was co-localized with PPP2R2A in the cytoplasm. The HEK293 cells were co-transfected with plasmids expressing FLAG-GFPT1/2 and HA-PPP2R2A, and after 24 h, cells were fixed and stained with anti-HA (green) and anti-FLAG (red)antibody. And the DAPI were used for nuclear staining.

2.4 PPP2R2A影响GFPT2的磷酸化水平

已有的报道显示PKA可导致GFPT1/2的磷酸化，为了检测PPP2R2A去磷酸酶对GFPT1/2磷酸化的影响，我们通过慢病毒感染并表达shRNA，建立PPP2R2A稳定下调的 HEK 293T细胞，Western blotting结果显示该shRNA有效下调PPP2R2A表达。再在该稳定细胞株中转染 mGST-GFPT1/2表达质粒，用GST-pull down将外源性表达的GST-GFPT1/2进行纯化，Anti-GST-WB检测结果显示在PPP2R2A稳定下调细胞和对照细胞中，GST-GFPT1和GST-GFPT2的表达量相同，同时用 PKA底物抗体检测其磷酸化水平，结果显示 PPP2R2A下调后，GFPT1磷酸化水平改变不明显，GFPT2磷酸化水平增加 (图4 A、B)。另外，在FLAG-GFPT2稳定表达的MDA-MB-231细胞株中使用shRNA下调PPP2R2A表达，通过 Anti-FLAG-IP沉淀 FLAGGFPT2蛋白，Anti-PKA substrate WB结果同样显示，PPP2R2A的下调可促进 GFPT2的磷酸化，与HEK293T中的结果一致 (图4 C)。

2.5 在 MDA-MB-231中下调 PPP2R2A促进O-连接的蛋白质糖基化修饰

己糖胺途径是一系列的酶促生化反应，最终生成UDP-GlcNAC，它是蛋白质的O-连接的丝氨酸-苏氨酸的糖基化修饰以及糖原、糖脂修饰的底物，GFPT2是己糖胺途径中的关键限速酶，于是我们又进一步检测 PPP2R2A下调对细胞内总蛋白S/T-O-GlcNAC糖基化的影响，使用O-GlcNAC抗体 (CTD110.6) 进行Western blotting检测，结果 (图4) 表明下调PPP2R2A后，乳腺癌细胞中蛋白质的 S/T-O-GlcNAC糖基化修饰的水平显著增加。

图4 PPP2R2A影响GFPT2的磷酸化水平Fig. 4 Knockdown of PPP2R2A enhanced phosphorylation of GFPT2. (A, B) Knockdown of PPP2R2A by lentivirus-mediated shRNA enhanced the phosphorylation of GFPT2, while the phosphorylation of GFPT1 had no significant change In HEK 293T. The plasmid of GST-GFPT1 or GFPT2 was further transfected into the normal and PPP2R2A-knockdown cells. GST Pull-down was used to precipitated the GFPT1 or GFPT2, and the phosphorylation was detected by the anti-PKA substrate immunoblotting. (C) In MDA-MB-231, knockdown of PPP2R2A enhanced the phosphorylation of GFPT2. MDA-MB-231 cells stably expressing FLAG-GFPT2 were established by infection with lentiviral particles. FLAG-GFPT2 was immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody, and phosphorylation of GFPT2 was analyzed by the anti-PKA substrate immunoblotting.

3 讨论

PP2A的活性和特异性是通过调节亚基调控的，PPP2R2A作为PP2A复合物的调节亚基之一，通过底物特异性结合从而影响其磷酸化水平[12-13]。已有的研究表明，肿瘤细胞中谷氨酰胺的缺乏会促进PPP2R2A的表达，进而通过抑制P53通路提高肿瘤细胞在此环境中的生存[9]。为了更加深入地解释PPP2R2A的分子作用机制，我们进一步寻找新的与PPP2R2A结合的其他蛋白。

本研究通过慢病毒感染建立 FLAG-SBP-HISPPP2R2A稳定表达 MDA-MB-231细胞株，并首次使用 SBP-HIS串联亲和纯化联合质谱的方式对PPP2R2A的结合蛋白进行了分析。与文献中常使用的其他串联标签纯化 (Tandem Tag Purification，TAP) 方法相比，该方式具有以下3个优点[14-16]：1) 通过慢病毒感染建立稳定表达细胞，PPP2R2A表达量与内源性PPP2R2A表达量大致相当，更好地模拟 PPP2R2A内源性表达量；2) SBP-tag与Streptavidin-beads具有极高的亲和力，再经过HIS8-tag纯化的方法后，进一步增加了PPP2R2A复合物的纯度[17]；3) 第二步HIS-tag的纯化不会引入其他过量的外源蛋白 (例如使用抗体时的免疫球蛋白或Streptavidin-beads上的Streptavidin)，从而消除了过量纯化基质蛋白引入对质谱分析的影响。

图5 PPP2R2A下调促进S/T-O-GlcNAC糖基化修饰Fig. 5 Cellular O-GlcNAcylation was elevated when PPP2R2A was knocked down in MDA-MB-231 cells.The PPP2R2A were knocked down by using the lentivirus-mediated shRNA, and the cellular O-GlcNAcylation was analyzed by anti-CTD110.6 immunoblotting.

通过该方法，我们鉴定出多个PPP2R2A已知结合蛋白及许多潜在的相互作用蛋白，其中包括GFPT1和GFPT2。通过GST Pull-down、Co-IP以及免疫荧光，我们进一步确定了PPP2R2A的确能够与GFPT1/2结合。人源GFPT1和GFPT2有76%的同源性[18]，自身酶的活性受磷酸化水平的调控[19]。例如，PKA可通过磷酸化GFPT1的205S (丝氨酸) 而抑制其活性，PKA也可磷酸化GFPT2的202S (丝氨酸) 促进其活性[20-21]。我们的结果显示PPP2R2A下调可增加GFPT2的PKA磷酸化水平。

GFPT1和GFPT2是己糖胺途径的限速酶，催化谷氨酰胺水解为谷氨酸，使 6-磷酸-果糖转化为 6-磷酸-葡萄糖胺。然后经一系列反应产生UDP-GlcNAC，它是蛋白质O-连接的丝氨酸-苏氨酸的糖基化修饰以及糖原、糖脂修饰的底物。参与细胞内的多条信号通路的调控[22-24]。我们的结果表明PPP2R2A下调后促进GFPT2磷酸化水平的同时，也会促进细胞内总O-GlcNAC糖基化修饰的增加。

在本研究中，我们还通过慢病毒感染在MDA-MB-231细胞中上调了PPP2R2A的表达，但未检测到GFPT2和O-GlcNAC糖基化修饰的改变，推测这是由于细胞本身就有很高的内源性PPP2R2A蛋白表达。例如，在图 1中内源性PPP2R2A蛋白与慢病毒感染表达的 FLAG-HISPPP2R2A蛋白量很近似；在图4C中PPP2R2A未下调的 MDA-MB-231细胞中基本检测不到GFPT2的磷酸化状态，这说明在细胞中具有高活性的PPP2R2A；同时我们也注意到，最近发表的一篇关于PPP2R2A去磷酸化EDD并调控P53的报道中[9]，作者同样仅开展了 PPP2R2A的下调研究，且在对照组中 EDD磷酸化水平也是几乎检测不到。这些均说明在细胞中具有很高的PPP2R2A活性，也提示PPP2R2A具有作为治疗靶标的潜力。

另外，在细胞中大约有 80多种蛋白发生O-GlcNAC糖基化修饰[25]，在接下来的研究中我们将进一步鉴定，哪种关键的下游蛋白 O-GlcNAC糖基化修饰的改变介导了 PPP2R2A下调引起的生物学效应。

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