韩 龙,吴水培
(1.安徽医科大学解放军九八临床学院,浙江 湖州 313000; 2.解放军九八医院,浙江 湖州 313000)
绝经后妇女因卵巢功能衰退,雌激素严重缺乏,骨吸收大于骨形成,易出现骨质疏松,表现为骨强度受损、骨组织显微结构退后和骨折危险性增加,骨质疏松可导致患者活动能力下降、躯体疼痛,严重者可导致骨折,严重影响患者的生活质量和生命安全[1]。目前西医治疗绝经后骨质疏松主要方法为抑制骨吸收和促进骨形成,激素替代疗法是常用的治疗方式,但激素替代可增加患者子宫内膜癌和血栓发生的风险,降低了患者治疗的依从性[2]。注射用骨肽是含有多种骨代谢的活性肽类,具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖,调节钙磷代谢,促进新骨形成,防治骨质疏松和促进骨折愈合等效果,是治疗骨质疏松的常用药物[3]。研究显示,钙吸收障碍和营养物质生物利用度降低也是导致骨质疏松的重要因素,肠道钙吸收以主动吸收为主,需要钙调节蛋白(CaBp-D9K)协助,CaBp-D9K活性降低可导致钙吸收障碍,导致骨质疏松发生,提高肠钙吸收率是防治绝经后骨质疏松的重要途径[4]。目前较少见注射用骨肽对CaBp-D9K影响的报道,本研究通过对注射用骨肽干预下观察去卵巢骨质疏松大鼠CaBp-D9KmRNA表达、骨密度、骨生物力学性能的变化,进一步探讨注射用骨肽治疗绝经后骨质疏松的作用机制,现将结果报告如下。
SPF级雄性SD大鼠,体重180~230 g,3月龄,由安徽医科大学实验动物中心提供 [SCXK(皖)2017-0018],在安徽医科大学实验动物中心进行实验[SYXK(皖)2017-0124],自由进食饮水,保持12 h昼夜节律,室温22℃~25℃,并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀,安徽医科大学实验伦理委员会批号:2017-0024。适应性饲养1周后进行建模,采用随机数字表法,选取24只SD大鼠作为空白组,不接受干预治疗;选取24只SD大鼠作为假手术组;在建模成功后随机选取48只SD大鼠分为2组,模型组和观察组,每组24只。空白组、假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,观察组给予注射用骨肽灌胃。
注射用骨肽购自黑龙江珍宝岛药业股份有限公司,规格:10 mg多肽;1,25(OH)2D3酶联免疫试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司;Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司;cDNA反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;CaBP-D9k、β-actin引物序列由大连宝公司合成。
Discovery-A骨密度仪购自美国好乐杰公司;高速离心机购自长沙湘锐离心机有限公司;Genios多功能酶标仪购自奥地利Tecan公司;RG-3000 Real-Time PCR仪购自北京照生行仪器设备有限公司; AG-IC20KN万能材料实验机购自岛津仪器苏州有限公司。
1.3.1模型的建立
空白组不予以处理,模型组和观察组参照文献[5],在SD大鼠适应性饲喂1周后,对大鼠进行建模,采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,背部正中切口,进入腹腔背侧,完整切除双侧卵巢,假手术组同样采用3%戊巴比妥钠麻醉,背部正中切口,进入腹腔背侧,切除小段肠系膜。术后均给予抗生素3 d预防感染。术后大鼠饲养条件同术前。
当改变煤体内孔隙压力分布后,裂隙偏向孔隙压力较高的方向扩展,其扩展方向与最大主应力方向的夹角大小可以反映出控制孔导控作用的强弱。如图8所示,控制水压为10 MPa时,裂隙偏角最大并与控制孔贯通,之后地应力占据主导作用,裂隙逐渐沿垂直最小主应力方向延伸,如图8d所示。
1.3.2药物干预
建模3个月后对实验动物进行干预,观察组:注射用多肽成人每日剂量10 mg,按60 kg计算,为0.17 mg/kg,大鼠等效剂量按成人每日用药量的6.3倍计算为1.07 mg/kg,取1.1 mg/kg,溶于1 mL生理盐水腹腔注射。模型组、假手术、空白组给予等量生理盐水腹腔注射。连续干预2个月。
1.3.3骨显微结构和骨密度检测
药物干预结束后采用micro-CT扫描股骨头至股骨中段,获取骨体积(BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)等参数;骨显微结构完成后采用Discovery-A骨密度仪检测股骨骨密度。
1.3.4血清1,25(OH)2D3和骨生物力学
大鼠麻醉后行腹主动脉取血,4℃静置20 min,3000 r/min离心20 min,取上清液,保存于-80℃冰箱,采用酶联免疫吸附法检测血清1,25(OH)2D3水平;分离大鼠左侧股骨采用三点弯曲实验[6]记录股骨最大载荷(指股骨断裂前所能承受的最大力)和断裂载荷值(股骨断裂时所承受的力)。
1.3.5小肠钙结合蛋白(CaBp-D9K)mRNA表达测定
取十二指肠以下10 cm小肠,无菌生理盐水冲洗干净,纵行剪开肠腔,刮下肠黏膜,采用Trizol法提取小肠组织总RNA,在反转录酶M-MLV作用下,将mRNA反转录成cDNA,采用RG-3000 real-time PCR仪扩增,反应条件:95℃ 2 min,95℃ 10 s,60℃ 40 s,40个循环,引物序列见表1。
空白组和假手术组BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp水平相比较差异均无显著性(P> 0.05);模型组BV、Tb.Th、Tb.N水平低于空白组和假手术组,Tb.Sp高于空白组和假手术组,观察组BV、Tb.Th、Tb.N水平低于模型组,Tb.Sp高于模型组,差异均有显著性(P< 0.05)。(见表2和图1)
空白组和假手术组骨密度、最大载荷、断裂载荷相比较差异均无显著性(P> 0.05);模型组骨密度、最大载荷、断裂载荷均显著低于空白组和假手术组(P< 0.05);观察组骨密度、最大载荷、断裂载荷均显著低于模型组(P< 0.05)。(见表3)
表1 CaBp-D9K和β-actin引物序列
表2 四组大鼠股骨显微结构参数相比较(n=24)
注:与空白组相比较,aP< 0.05;与假手术组相比较,bP< 0.05;与模型组相比较,cP< 0.05。
Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.
图1 四组大鼠股骨显微结构的micro-CT图像Fig.1 Micro-CT images of the microstructure of the femur of the four rat groups
组别Groups骨密度(g/cm2)Bone Density最大载荷(N)Maximum Load断裂载荷(N)Breaking Load空白组Blank Group0.258±0.01733.738±2.38259.644±3.518假手术组Sham Operation Group0.253±0.02132.846±2.42358.859±4.136模型组Model Group0.218±0.026ab20.541±3.609ab45.261±2.634ab观察组Observation Group0.238±0.019abc27.457±2.810abc53.868±3.714abc
注:与空白组相比较,aP< 0.05;与假手术组相比较,bP< 0.05;与模型组相比较,cP< 0.05。
Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.
表4 四组血清1,25(OH)2D3和小肠CaBp-D9K mRNA表达相比较(n=24)
注:与空白组相比较,aP< 0.05;与假手术组相比较,bP< 0.05;与模型组相比较,cP< 0.05。
Note. Compared with the blank group,aP< 0.05. Compared with the sham operation group,bP< 0.05. Compared with the model group,cP< 0.05.
空白组和假手术组血清1,25(OH)2D3和小肠CaBp-D9KmRNA表达相比较差异均无显著性(P> 0.05);模型组血清1,25(OH)2D3和小肠CaBp-D9K mRNA表达均低于空白组和假手术组,观察组血清1,25(OH)2D3和小肠CaBp-D9K mRNA表达均低于模型组,差异均有显著性(P< 0.05)。(见表4)
肠道钙的吸收包括被动扩散过程和主动跨细胞过程,主动跨细胞转运过程是肠道钙的吸收主要方式,需要CaBp-D9K协助完成转运过程。CaBp-D9K分子量为9000,是受活性维生素D调节的钙转运蛋白,其主要功能是提高维生素D依赖性细胞内钙转运,增加钙离子通过细胞弥散的速度,使钙离子快速从细胞顶端到达基底侧,因此小肠CaBp-D9K含量与肠道钙吸收能力成正比[7]。绝经女性雌激素水平降低可导致继发性甲状旁腺和维生素D合成减少,导致肠道功能缺陷,随着年龄增加,肠黏膜CaBp-D9K表达逐渐降低,70岁的人较其青年时期的CaBp-D9K降低超过50%,因此,CaBp-D9K表达降低是绝经后骨质疏松高发的重要因素[8]。1,25(OH)2D3是维生素D3的活性代谢产物,可与维生素D受体结合调控CaBp-D9K活性,外源性1,25(OH)2D3补充可增加CaBp-D9K基因转录[9]。
本研究采用去卵巢大鼠复制女性绝经后骨质疏松动物模型。去卵巢后实验动物体内雌激素水平降低,骨吸收增强,骨生长减弱,骨量丢失,逐步形成骨质疏松模型。本研究结果显示,模型组骨密度、最大载荷、断裂载荷、BV、Tb.Th、Tb.N水平低于空白组和假手术组;Tb.Sp高于空白组和假手术组;观察组骨密度、最大载荷、断裂载荷、BV、Tb.Th、Tb.N水平均高于对照组,Tb.Sp低于模型组。结果提示,注射用骨肽可促进去卵巢骨质疏松大鼠骨量增加,骨小梁连接更为紧密,对去卵巢所致骨质疏松具有良好的治疗作用,与有关研究[10]一致。本研究结果显示,模型组血清1,25(OH)2D3水平和小肠CaBp-D9k mRNA表达均显著低于空白组和假手术组,提示肠黏膜CaBp-D9k mRNA表达降低所致钙吸收障碍可能是去卵巢大鼠骨质疏松发生的重要因素,与有关研究[8-9]一致。本研究结果同时显示,观察组血清1,25(OH)2D3水平和小肠CaBp-D9k mRNA表达均高于模型组,提示注射用骨肽可通过提高1,25(OH)2D3水平,增加小肠CaBp-D9k mRNA表达,促进肠道钙吸收。
综上所述,注射用骨肽可降低去卵巢大鼠骨质疏松程度,增加小肠CaBp-D9k mRNA表达,促进肠钙吸收可能是其重要作用机制。