心房钠尿肽在基因敲除小鼠黑色素瘤肺转移中的作用

亓翠玲，曹静桦，何亚军，李倩明，李梦诗，杨　扬，王丽京

(广东药科大学，基础学院血管生物学研究所，广州　510006)

钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)家族是人们在心和脑中发现的一种与水钠代谢有关的肽类激素家族，包括心房钠尿肽[1]、脑钠肽(BNP)[2]、C-型尿钠肽(CNP)[3]和树眼镜蛇性利尿钠肽(DNP)[4]。心房钠尿肽是由心房合成并储存的的一种活性多肽，具有利钠利尿、扩张血管、降低血压等作用。心房钠尿肽与高血压、心和肾功能不全、妊娠相关疾病及肺水肿等疾病具有密切的关系。但是，关于ANP对肿瘤发生发展的作用报道不多，本文利用ANP敲除小鼠建立黑色素瘤肺转移模型，研究ANP对黑色素瘤肺转移的作用。

1　材料和方法

1.1　实验动物

ANP敲除纯合子小鼠(ANP-/-)，由耿建国教授惠赠，SPF级，6～8周龄，体重18～20 g，雄性2只，雌性4只。SPF级雌性C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体重18～20 g，10只，购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2008-0002]。小鼠饲养及操作均在广东药科大学实验动物中心进行[SYXK(粤) 2012- 0125]，并严格遵守广东药科大学动物伦理的规定(福利伦理审查证：gdpulac2015014)。

1.2　细胞

B16F10黑色素瘤细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库，常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。

1.3　实验方法

1.3.1肺转移小鼠模型建立

肺转移小鼠模型根据文献报道建立[5]，简单概括为：把处于对数生长期的B16F10细胞用胰酶消化后，用无菌PBS调整细胞密度为1×105/mL，用台盼蓝染色确定活细胞数在95%以上，通过尾静脉给每只小鼠注射0.2 mL(1×105个细胞)。B16F10细胞接种后21 d，安乐死处死小鼠，分离小鼠肺，在倒置显微镜下计数肺表面转移肿瘤的数目。

1.3.2病理检查

肿瘤组织石蜡包埋后，切片。将切片脱蜡至水，自来水清洗，用苏木素染色，自来水冲洗，1%盐酸乙醇酸化后返蓝，用伊红染色，脱水用中性树胶封片。在显微镜下计数转移到肺组织中的结节数目。

1.4　统计学方法

2　结果

2.1　ANP敲除抑制了黑色素瘤B16F10细胞的肺转移

注：与C57BL/6J小鼠比，*P < 0.05。图1　ANP敲除对黑色素瘤的肺转移的作用Note. Compared with the C57BL/6J mice，*P < 0.05.Fig.1　Effect of ANP deletion on the number of metastatic foci on the mouse lung surface

2.2　ANP敲除对肺组织中微转移结节数目的影响

转移模型建立后的第21天，处死小鼠，分离小鼠肺组织，固定、包埋、切片后，HE染色，C57BL/6J小鼠及ANP敲除小鼠的肺组织中都有黑色素瘤转移结节(见图2A和2B)，发现ANP敲除小鼠肺组织中微转移结节的数目明显比C57BL/6J少(见图2C)。

3　讨论

注：(A、B)C57BL/6J小鼠及ANP敲除小鼠肺组织的HE染色图(Bar=500 μm)及局部转移结节的放大图(Bar=50 μm)；与C57BL/6J小鼠比较，***P< 0.001。图2　ANP敲除显著抑制了肺组织中微转移结节数目Note. Compared with the C57BL/6J mice，***P < 0.001.Fig.2　Effect of ANP deletion on the number of micrometastatic foci in the mouse lung tissues revealed by histopathology. HE staining

心房钠尿肽作为一种经典的血管活性肽，在肿瘤中的作用研究甚少。本研究利用ANP敲除小鼠和C57BL/6J小鼠，通过尾静脉注射黑色素瘤B16F10细胞，建立黑色素瘤肺转移瘤小鼠模型。利用ANP敲除小鼠研究黑色素瘤对肺转移的作用，较其它模型具有一大优点：ANP基因的作用在小鼠中被完全消除，更能明确证实ANP基因在黑色素瘤肺转移中的作用。本研究利用ANP敲除小鼠建立肺转移模型，此模型具有肿瘤发生率高、容易建立、时间短、肿瘤转移均一性好、个体差异小等优点。利用此小鼠模型，我们发现ANP敲除显著抑制了黑色素瘤的肺转移。但文献报道用ANP治疗DMBA (initiator)/croton oil诱导的小鼠皮肤癌，发现ANP通过激活NF-κB信号、肥大细胞及MMP2/9显著抑制了皮肤癌的生长[6]。Takashi等[7]也报道ANP通过抑制肺癌A549细胞与内皮细胞粘附，进而抑制了肿瘤的肺转移。这些研究与我们的研究结果相反，需要进一步探讨。与我们研究不一致的原因可能如下：我们是利用ANP敲除小鼠研究ANP对黑色素瘤的肺转移的作用，主要观察ANP基因对肿瘤的作用，而Takashi等主要是用ANP蛋白治疗肿瘤小鼠模型，研究ANP蛋白对肿瘤的作用，ANP在基因水平及蛋白水平对肿瘤的作用可能不一致。

综上所述，ANP与黑色素瘤的肺转移有着密切的关系，在黑色素瘤的肺转移中发挥着正向调控的重要作用，但ANP对B16F10黑色素瘤细胞肺转移的作用机制还不明确，需要进一步的探讨。若进一步探讨ANP对肿瘤的作用，可为判断患者预后及寻找理想的抗肿瘤治疗靶点提供重要的理论依据。

参考文献：