血清微小核糖核酸-133b水平与老年糖尿病肾病患者肾脏损伤及预后的相关性

韩辉，林书典，陈道军，武伟

(海南省人民医院肾病风湿科，海口 570000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是2型糖尿病患者的常见并发症，早期干预可逆转微量蛋白尿，如不及时治疗可导致慢性肾衰竭甚至死亡[1，2]。随着我国人口老龄化日趋严重，老年DN的患病率呈逐年上升趋势，给社会及家庭带来了沉重的经济负担。微小核糖核酸(microribonucleic acid, miRNA)是一类小的非编码RNA分子，广泛参与细胞增殖、凋亡及免疫炎症反应等多种机体生物学过程的调控[3，4]。近年来研究发现，miR-133b可能参与肾间质纤维化和肾小管上皮间质转化等过程，亦可能参与DN的发生和发展[5]。本研究通过检测老年DN患者血清miR-133b水平，分析miR-133b与老年DN患者肾脏损伤及远期预后的关系，旨在为老年DN的早期治疗提供依据。

1　对象与方法

1.1　研究对象

选取2016年1月至2017年12月海南省人民医院肾病风湿科收治的老年2型DN患者182例作为研究对象(DN组)。纳入标准：(1)符合美国糖尿病协会2型糖尿病诊断标准[6]；(2)经过肾活检诊断为DN或临床特点符合DN；(3)年龄≥60岁。排除标准：(1)急性或慢性肾小球肾炎、尿路感染及其他肾脏疾病；(2)合并酮症酸中毒、甲状腺疾病或其他代谢性疾病；(3)近期应用免疫抑制剂或服用肾毒性药物。另选择同期来我院体检的健康老年人80名作为对照组，均无心、脑、肝、肾病变，无糖尿病、高血压及其他代谢性疾病。本研究经本院伦理委员会批准(2016AB08035116)，并获得患者或家属签署的知情同意书。

1.2　研究方法

收集182例患者肾活检或入院后次日的临床资料，包括年龄、性别、糖尿病病程、体质量指数(body mass index,BMI)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin Alc,HbAlc)、血肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、24 h尿蛋白定量、估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、血清钙(calcium,Ca2+)等指标。采用肾病分级、间质性纤维化和小管萎缩(interstitial fibrosis and tubular atrophy，IFTA)评分及间质炎症来评价肾脏损伤情况，级别或评分越高，说明肾脏病理损伤越重。

再根据DN组患者miR-133b水平的平均值(5.38±1.28)将182例老年DN患者分为高表达组和低表达组，分析老年DN患者血清miR-133b水平与患者预后的关系。

1.3　实时荧光定量聚合酶链反应

抽取所有研究对象的空腹静脉血3 ml置于未加抗凝剂的离心管中，轻轻颠倒数次后静置10 min，于室温2500转/min离心15 min，分2层，吸取上层血清400 μl转移至EP管中，-70℃保存。严格按照试剂盒说明书提取血清总miRNA，通过反转录试剂盒将总miRNA逆转录为cDNA,U6为内参照，ABI 7500型实时荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)进行扩增并对PCR结果进行定量分析。扩增条件：95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃退火60 s进行45个循环，最后38℃延伸5 s。实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到设定阈值所经历的循环数即为Ct值，以U6为内参照，采用2-△△Ct法计算miR-133b的相对表达水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6，△△Ct=△Ct对照目的基因-△Ct实验目的基因。

1.4　肾脏结局

终末期肾病(end-stage renal disease, ESRD)定义为eGFR<15 ml/(min·1.73 m2)或开始接受维持性肾脏替代治疗。

1.5　统计学处理

2　结　果

2.1　DN组与对照组患者基线资料比较

DN组男性98例，女性84例，年龄60～84(68.2±7.1)岁；对照组男性42例，女性38例，年龄60～78(66.8±7.2)岁。2组年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。DN组血清miR-133b水平(5.38±1.28)明显高于对照组(1.06±0.25)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2　影响血清miR-133b水平的单因素分析

不同的糖尿病病程、24 h尿蛋白定量、SCr、BUN及eGFR水平间血清miR-133b比较，差异有统计学意义；老年DN患者不同肾病分级、IFTA评分及间质炎症分级间血清miR-133b水平比较，差异亦均有统计学意义(P<0.05)，且随着肾脏病理损伤程度的增加，血清miR-133b水平显著升高(P<0.05；表1)。

2.3　血清miR-133b水平与各临床指标的相关性分析

Pearson相关分析显示，患者血清miR-133b水平与24 h尿蛋白定量、SCr、BUN、肾病分级、IFTA及间质炎症呈正相关(r分别为0.492、0.382、0.415、0.463、0.338、0.547，P<0.01)，与eGFR水平呈负相关(r=-0.625，P<0.01)。

2.4　老年DN患者血清miR-133b水平与预后的关系

取老年DN患者血清miR-133b水平的平均值(5.38±1.28)为界限，将182例DN患者分为低表达组94例和高表达组88例。最终有76例进入ESRD，其中miR-133b高表达组(65.9%，58/88)相对于低表达组(19.1%，18/94)进入ESRD的比例显著增加(χ2=6.175，P=0.006)。

3　讨　论

DN是2型糖尿病患者最常见且最严重的慢性合并症，在老年人中的发病率明显升高，已成为危害人类的重大疾病[7]。目前，对DN的早期诊断和预后评估是肾脏病学研究的热点问题。miRNA是一种内源性的非编码微小RNA，其广泛存在于真核细胞中，长度约为22个核苷酸，通过转录后调控靶基因表达，参与各种重要的生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡、免疫、发育、代谢、病毒感染及肿瘤发生等[8，9]。已有研究证实，一些miRNA参与DN的发生发展，影响细胞结构和功能及微环境，并形成一个错综复杂的网络，有可能成为DN新的治疗靶点[10，11]。最近研究表明，检测miRNA对DN的早期诊断、疾病发展程度、疗效判断、预后观察、特异性药物设计等方面都具有重要的意义，未来以miRNA为靶点开发的药物将有望应用于DN的治疗[12]。He等[13]研究发现，在DN患者的血清和肾组织以及糖尿病小鼠中miR-135a高表达，通过抑制瞬时受体电位阳离子通道C1(transient receptor potential canonical channel-1,TRPC1)水平，阻断Ca2+进入细胞内，使纤连蛋白和胶原蛋白沉积，促进细胞外基质沉积，而TRPC1过表达能扭转miR-135a所致的系膜细胞增殖和细胞外基质蛋白的沉积，进而促进DN的发生发展。Eissa等[14]通过采用qRT-PCR法检测DN患者和健康对照组尿液miR-133b、miR-342及miR-30a水平，发现DN患者尿液miR-133b、miR-342及miR-30a水平明显高于对照组(P<0.01)，提示这3种miRNA可能作为DN患者的尿生物标志物。本研究显示，DN组血清miR-133b水平明显高于对照组，且影响miR-133b水平的因素有糖尿病病程、24 h尿蛋白定量、SCr、BUN及eGFR水平，其中糖尿病病程≥10年、24 h尿蛋白定量≥3.0 g/24 h、SCr≥150 μmol/L、BUN≥7.5 mmol/L及eGFR<60 ml/(min·1.73 m2)患者的血清miR-133b水平较高，提示血清miR-133b水平与DN患者的病情严重程度相关，可能参与DN的发生发展。DiStefano等[15]研究发现，血清miRNA水平变化可反映肾功能及肾脏损伤情况，在DN的诊断及预后预测上有一定的指导价值。另有研究表明，循环miRNA可能参与DN的病理机制，如脂质代谢紊乱、氧化应激、细胞外基质沉积及肾纤维化，有望作为2型DN早期诊断的新型标志物[16]。

表1影响血清miR-133b水平的单因素分析

Item miR-133b levelP valueAge0.262 ≤70 years5.24±1.20 >70 years5.62±1.37Gender0.379 Male5.36±1.25 Female5.52±1.31BMI0.313 <25 kg/m25.28±1.22 ≥25 kg/m25.48±1.26Length of diabetes mellitus0.008 <10 years3.93±0.74 ≥10 years6.52±1.63Proteinuria0.028 <3.0 g/24 h4.50±1.02 ≥3.0 g/24 h6.27±1.56Ca2+0.427 <2.0 mmol/L5.58±1.34 ≥2.0 mmol/L5.25±1.21FBG0.205 <8.0 mmol/L5.13±1.16 ≥8.0 mmol/L5.64±1.35HbA1c0.191 <9.0%5.18±1.20 ≥9.0%5.71±1.39SCr0.005 <150 μmol/L4.42±0.94 ≥150 μmol/L6.53±1.56BUN<0.001 <7.5 mmol/L4.28±0.85 ≥7.5 mmol/L6.64±1.70eGFR<0.001 <60 ml/(min·1.73 m2)7.42±1.93 ≥60 ml/(min·1.73 m2)3.81±0.68Nephrotic grade0.018 Ⅰ4.15±0.83 Ⅱ4.86±1.05 Ⅲ5.52±1.36 Ⅳ7.24±1.80IFTA(score)0.036 04.06±0.78 14.73±1.07 25.64±1.45 36.39±1.61Interstitial inflammation(score)0.025 04.90±1.16 15.87±1.72 26.72±1.81

DN: diabetic nephropathy; BMI: body mass index; FBG: fasting blood glucose; HbA1c: glycosylated hemoglobin A1c; SCr: serum creatinine; BUN: blood urea nitrogen; eGFR: estimated glomerular filtration rate; IFTA: interstitial fibrosis and tubular atrophy

DN的主要病理改变是肾小球硬化，其中肾脏系膜细胞、足细胞及肾小管上皮细胞等多种细胞的损伤，均参与肾小球硬化。miRNA参与系膜细胞肥大、细胞外基质沉积、足细胞凋亡以及肾小管间质纤维化，共同导致肾小球硬化[17]。在DN的发生和发展过程中，改善肾脏损伤及早期干预是DN救治的关键。本研究采用肾病分级、IFTA及间质炎症共3个指标来评价肾脏损伤程度，结果显示老年DN患者不同肾病分级、IFTA及间质炎症间血清miR-133b水平差异均有统计学意义，且随着肾脏病理损伤程度的增加，血清miR-133b水平显著升高，提示血清miR-133b水平与肾功能进展及严重程度密切相关，可作为预测DN进展的重要指标。肾小球间质性损伤可影响管球反馈平衡，加重肾小球滤过压，继而使肾小球上皮受损，最终导致疾病进展及发生ESRD。本研究中miR-133b高表达组相对于低表达组发展为ESRD的比例增加，推测高水平的miR-133b可产生细胞毒性，导致间质纤维化、小管萎缩和间质炎症。Pearson相关分析显示，ESRD患者血清miR-133b水平与24 h尿蛋白定量、SCr、BUN、肾病分级、IFTA及间质炎症呈正相关，与eGFR水平呈负相关，进一步提示血清miR-133b水平与肾脏病理损伤程度及DN预后不良有关。Bhatt等[18]研究亦表明，当肾小管间质损伤时，血液中miRNA水平显著升高，而肾小管间质损伤与DN患者肾脏预后不良显著相关，这与本研究结果类似。

综上所述，老年DN患者血清miR-133b水平明显升高，且其水平与老年DN患者肾脏损伤及预后有关，miR-133b水平较高的患者肾脏损伤程度较严重且预后较差，因此，检测miR-133b对老年DN的病情判断及预后评估具有一定价值，同时亦为阐明DN发病的分子机制提供新的线索。