二噁英暴露对成年男性血清类固醇激素的影响

沈 斌 ,施丽丽 ,董晶剑 ,冯 昊 ,沈林杰 ,项 菁 ,李文静 ,罗 挺 ,城户照彦 ,孙献亮 ,*(.嘉兴学院医学院,浙江 嘉兴 3400；.日本金泽大学医药保健学院保健学系,日本 金泽 908640)

二噁英是多氯代二苯并二噁英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)的统称,主要来源于金属冶炼、矿石烧结、水泥制造、废物焚烧等大型工业生产及生活垃圾焚烧[1-4].二噁英作为一种持久性有机污染物,脂溶性高,极难降解,在生物体内的半衰期约为 7～11a,影响持久[5],对环境和人类健康造成严重危害.长期接触二噁英会造成免疫系统、发育中的神经系统、内分泌系统以及生殖功能的损害[6],其中最主要的危害是对内分泌的干扰.动物实验发现,二噁英类物质中毒性最强的四氯二苯并二噁英(TCDD)通过影响小鼠芳香烃受体(AhR)的表达,降低类固醇激素孕酮、雄烯二酮、睾酮和雌二醇水平[7],此外,TCDD通过影响芳香酶(CYP19A1)的活化,降低雌二醇分泌[8].流行病学研究发现,二噁英的潜在暴露会导致儿童类固醇激素睾酮、雌二醇水平降低[9],脱氢表雄酮水平升高[8].而成年女性暴露二噁英导致皮质醇和可的松水平升高[11].近年关于越南战争期间服役的美军退役士兵的研究中发现,TCDD暴露导致男性士兵睾酮水平降低[12],患前列腺癌症的风险提高[13-14].然而上述动物实验与美军退役士兵的研究中并未对其他种类的二噁英同类物进行测定.

在越南战争期间美军使用了大量含有二噁英的枯叶剂,对当地环境和居民健康造成了严重危害.虽然二噁英的使用(1962～1971年)已经过去了40多a,但是污染地区土壤中、周边居民血液中的二噁英浓度仍比非污染地区高出 3-5倍[15-16].由于二噁英分析属于超痕量分析,分析成本高,故在越南国内关于二噁英对人体健康危害的研究较少.为了解二噁英暴露对越南成年男性类固醇激素分泌的干扰,本研究于 2011～2012年对二噁英污染地区的50名成年男性和非污染地区的48名成年男性的血清中9种类固醇激素和17种二噁英同类物进行了调查分析.

1 材料与方法

1.1 研究区域

污染地区选择了越南Bien Hoa地区,在越南战争期间存放了大量农药并大量喷洒使用. Bien Hoa位于越南Dong Nai省,是越南南部3个具有代表性的二噁英污染地区之一[15-16].研究区域详见图1.

图1 研究区域Fig.1 Map of Vietnam and study areas

1.2 样品采集

本研究随机选取二噁英污染地区50名男性和非污染地区48名男性为受试者,所有被试者的年龄均在50岁以上,在调查地区居住时间40a以上,为确保类固醇激素检出的准确性,所有样品的采集均在上午8:00～10:00之间进行,采集血液样本 10mL,离心后血清放入采样小瓶内,保存于放有干冰的冷藏盒内.采样结束后统一存放于-30℃低温冰箱内直到分析测试.

1.3 样品处理与分析

1.3.1 血清中二噁英的测定(1)实验材料 正已烷、甲苯(色谱纯,美国Heneywell公司);二氯甲烷(色谱纯,德国 Merck公司);乙酸乙酯(色谱纯,日本Wako公司);硅藻土(德国Merck公司);二噁英标准物质(除去 2,3,7,8-TeCDF、2,3,7,8-TeCDD浓度为40ng/mL,OCDD、OCDF浓度为400ng/mL,其他浓度均为200ng/mL)、13C12标记的二噁英回收内标标准溶液(除13C12浓度为200ng/mL外,其余浓度均为100ng/mL)、13C12标记的二噁英添加内标标准溶液(浓度为200ng/mL)(美国Well-labs,Wellington公司).

(2)样品前处理

取4mL血清加入10µL13C12标记的二噁英标准溶液,然后转移至少量硅藻土上,在-40℃冰箱冷冻 6h后,放入冷冻干燥机干燥.冻干后样品加入适量硅藻土研磨混匀后,加于快速溶剂提取仪的萃取池中(ASE350,美国 Thermo Fisher Scientific公司),配制体积比为1:1的正己烷与二氯甲烷混合溶剂作提取溶剂,用 ASE350提取样品中的二噁英.

(3)样品的纯化

将提取液转移至250mL茄形瓶中,浓缩至恒重,称取并记录脂肪重量,加入10µL13C12标记的二噁英标准溶液和150mL正己烷混匀,在45℃下减压旋蒸至 5mL,以全自动净化系统进行净化(Fluid Management System,美国 FMS 公司),收集含有二噁英的洗脱液.将收集的二噁英洗脱液过酸性硅胶柱,洗脱液浓缩至微干,加 5µL13C12标记的二噁英作为内标标准溶液,并转至锥形样品瓶中待上机检测.

(4)仪器分析

采用HP6890HRGC(美国Hewlett Packard公司)和 JEOL JMS-S700HRMS(美国 Therm Finnigan公司)联用分析仪.

色谱条件:DB-5MS(60m×0.25mm×0.25L)色谱柱对17种二噁英单体进行分离.色谱柱升温程序:初始温度80℃保持2min,以20℃/min速率升至180℃,再以5℃/min速率升至300℃保持3min.

质谱条件:电离方式,ESI源;电离能量,35eV;采用选择离子(SIM)测定;离子源温度,300℃.

(5)质量控制

严格按照美国国家环保局EPA1613方法对样品分析过程进行质量控制,确保数据的准确.采用13C同位素内标稀释定量法对血清中二噁英进行定量.背景干扰以扣除实验空白为准.结果表明,空白实验组的回收率介于 33.4%～119%;样品回收率范围:30%～120%,在EPA检测方法的可接受范围之内.

1.3.2 血清中类固醇激素的测定(1)主要仪器和试剂 API4000三重四极杆质谱仪(加拿大MDS Sciex公司);Agilent1100高效液相色谱系统及PTC自动进样器(德国 Waldbronn公司);高速离心机(日本Shimadazu公司)等.

皮质醇、可的松、孕酮、雄烯二酮、雌酮(Estrone)、睾酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、雌二醇标准品(德国 Merck公司);甲醇(色谱纯,美国Heneywell公司);乙酸乙酯(色谱纯,日本Wako公司);羟胺(日本 Wako公司)等.

(2)混合标准溶液的配置

分别称取适量标准品用乙酸乙酯准确定容,然后分装并放置-70℃保存备用.取少量标准品乙酸乙酯溶液用甲醇准确定容稀释成浓度为100ng/mL的标准溶液,置于-30℃保存.按照9种类固醇激素在人体血清中的大致含量将标准品按比例配制成混合标准品,再用生理盐水稀释到不同浓度.配制浓度为 100ng/mL的皮质醇-2H4(1ng),脱氢表雄酮-2H4(100pg),孕酮-13C3(100pg),雌酮-13C4(100pg)和雌二醇-13C4(100pg)混合内标水溶液备用.

(3)样品前处理

取 200µL血清加入 1.5mL离心管中,加100ng/mL混合内标溶液 20µL,再加入 600µL乙酸乙酯,涡旋振荡 10min,12000×g离心 5min,4℃静置30min后取上清液用氮吹仪吹干,加入羟胺100µL,混匀振荡 10min,再放入恒温箱 60℃衍生化反应1h,待上机检测.

(4)仪器分析

采用AT1000LC和API4000MS联用分析仪(LC-MS/MS).

色谱条件:采用 Phenomenex C18反相色谱柱(100mm×2.1mm, 2.6µm)和 PhenomenexC18 预保护柱.流动相A为H2O(含0.1%甲酸),流动相B为甲醇(含 0.1%甲酸).柱温为 35℃,进样体积为20µL.

质谱条件:电离方式, ESI源;采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式.喷雾电压(IS)为5500V;碰撞气(CAD)为 Medium;气帘气(CUR)为40kPa;离子源雾化气(GS1)和加热辅助气(GS2)均为60kPa;去溶剂温度为550℃.

1.4 统计学方法

采用 SPSS 12.0软件和 JMP @ 9软件包(SAS institute,Cary,NC,USA)进行数据统计分析.本文中数据由均值±SD或由中位数及四分位数间距来表示.采用 Student t检验(正态分布)或Mann-Whitney U检验(非正态分布)进行组间比较.由于血清中的二噁英浓度和类固醇激素浓度均为非正态分布,故采用 spearman相关分析法,进行相关分析.

2 结果

2.1 两个地区受试者人群特征的比较

本文随机选取二噁英污染地区的 50名成年男性及非污染地区的 48名成年男性作为受试者.如表1所示,两个地区的受试者年龄、体质指数(BMI)、受教育程度上没有显著性差异.在居住时间上,污染地区的受试者的居住时间明显长于非污染地区的受试者,且所受试者在该地区的居住时间均在50a以上.从而确保了受试者在越南战争期间到调查实施期间都居住在所调查地区.

表1 两个地区受试者人群特征的比较Table 1 Demographic characteristics of participants in the two areas

2.2 两个地区受试者血清中类固醇激素水平的比较

两个地区男性受试者血清类固醇激素水平如表 2所示,二噁英污染地区及非污染地区受试者体内皮质醇、可的松、孕酮、雄烯二酮、雌酮水平没有显著性差异(P＞0.05).污染地区受试者血清中睾酮、双氢睾酮、雌二醇的水平均高于非污染地区,而脱氢表雄酮的水平低于非污染地区,差异均有统计学差异(P＜0.05).

表2 两个地区男性受试者血清类固醇激素水平的比较Table 2 Comparison of serum levels of steroid hormones in males from the two areas

2.3 两个地区受试者血清中二噁英浓度的比较

表 3是对两个地区男性受试者血清中 17种二噁英同类物浓度的比较.从结果可知,在二噁英污染地区受试者血清中的各二噁英同类物中除2378-TeCDF、12378-PeCDF、123789-HxCDF、1234789-HpCDF、OCDF外,其他 12种二噁英同类物及PCDDs、PCDFs、PCDD/DFs毒性当量均高于非污染地区,各差异均有统计学意义(P＜0.05).其中 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、OCDD、123478-HxCDF、123678- HxCDF、1234678-HpCDF的浓度比非污染地区高 5～10倍.PCDDs、PCDFs、PCDD/DFs毒性当量比非污染地区高3倍以上.

表3 两个地区男性受试者血清中二噁英水平的比较Table 3 Comparison of serum levels of dioxins in males from the two areas

续表3

2.4 两个地区受试者血清中类固醇激素与二噁英的相关性

表4可见,雌二醇的水平与17种二噁英同类物 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、1234678-HpCDF呈显著性正相关.睾酮的水平与 123678-HxCDD、1234678-HpCDD、OCDD、1234678-HpCDF呈显著性正相关,双氢睾酮的水平与1234678-HpCDD、OCDD呈显著性正相关.脱氢表雄酮的水平与 123678-HxCDD呈显著性负相关.皮质醇、可的松、孕酮、雄烯二酮、雌素酮的水平与二噁英浓度没有显著性相关(数据未显示).

表4 两个地区类固醇激素与二噁英的相关性Table 4 Correlation between steroid hormones and dioxins in the two areas

2.5 年龄与类固醇激素的相关性

表 5可见,污染地区成年男性血清中睾酮、双氢睾酮、雌二醇的水平随年龄的增长而增高,而脱氢表雄酮的水平随着年龄增长而降低,以上相关性均具有统计学意义(P＜0.05).二噁英非污染地区男性血清中双氢睾酮、睾酮、雌酮、脱氢表雄酮的水平变化与普通男性变化趋势一致[17-19].

表5 年龄与类固醇激素的相关性Table 5 Correlation of steroid hormones and age

续表5

3 讨论

越南战争已经过去了40多a,二噁英在人体血清中的浓度大幅降低[16,20],但本研究污染地区成年男性血清中二噁英毒性当量仍比非污染地区高出3倍以上.

本研究发现,睾酮的水平与二噁英同类物123678-HxCDD、1234678-HpCDD 、OCDD、1234678-HpCDF呈显著性正相关,二噁英污染地区睾酮水平明显高于非污染地区,且水平随着年龄的增长而升高.男性睾酮由睾丸分泌,肾上腺亦分泌少量睾酮,一般成年男性的睾酮水平随年龄的增长而降低[19].动物实验研究发现雄性大鼠的脑垂体可能是二噁英的靶器官,二恶英的暴露导致脑垂体机能下降,从而干扰血浆睾酮、雌二醇之间的正常反馈机制,导致睾酮、雌二醇水平异常[21].然而Araki等[22]在人群实验研究中发现,婴儿脐带血中睾酮水平的变化与其睾丸间质细胞和血清细胞相关.因此,我们认为二噁英对人体类固醇激素睾酮的影响机制与动物不同,本研究中污染地区成年男性睾酮水平的增高可能是由二噁英直接作用与睾丸间质细胞和血清细胞引起.

双氢睾酮可由睾丸直接生成,也可由睾酮与人体内 5α-转化酶反应后生成[23].本研究发现,双氢睾酮的水平与1234678-HpCDD、OCDD呈显著性正相关,二噁英污染地区双氢睾酮水平明显高于非污染地区,且水平随着年龄的增长而升高.研究发现,二噁英暴露与 5α-转化酶活性之间没有显著的相关性[24].本研究中双氢睾酮水平的增高可能与睾酮水平的增高相似,即由二噁英直接作用与睾丸间质细胞和血清细胞引起.

本研究发现,雌二醇的水平与 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、1234678-HpCDF呈显著性正相关,二噁英污染地区成年男性血清中雌二醇的水平明显高于非污染地区,且水平随年龄的增长而增高.作为男性雌激素中活性最高的雌二醇,其水平的变化与睾酮水平相关,睾酮在芳香化酶作用下可转化为雌二醇[25].最新的研究发现,二噁英暴露导致肿瘤块中芳香烃受体表达水平增加,雌二醇可能通过雌激素受体与芳香烃受体之间的相互作用而影响芳香烃受体的表达[26].本研究中二噁英污染地区雌二醇水平的升高可能是,二噁英暴露导致的芳香烃受体与雌激素受体表达变化与睾酮水平升高共同作用的结果.

多项研究表明,高水平的睾酮与低水平的性激素结合球蛋白会导致成年男性患前列腺癌症风险增加[27-28],雌二醇与雄激素协调作用会诱发前列腺疾病[29].另外研究发现,低水平双氢睾酮的成年男性罹患前列腺癌的分险系数较低[30].前列腺作为睾酮、双氢睾酮和雌二醇的目标器官被人们熟知.由此推测,二噁英暴露导致的睾酮、双氢睾酮和雌二醇水平的增高可能会诱发前列腺疾病.由于本次研究并未对被试前列腺疾患进行诊断,因此,这一结论有待在今后的研究中进一步验证.

研究表明,人体脱氢表雄酮水平随年龄的增长而降低,是人类衰老的生物标志物[31].本研究中,脱氢表雄酮的水平与123678-HxCDD呈显著性负相关,二噁英污染地区成年男性脱氢表雄酮水平随年龄降低的趋势明显大于非污染地区(污染地区vs非污染地区r= -0.3177vs r= -0.1957),二噁英暴露可能加速人体衰老.此外发现,二噁英暴露会导致促肾上腺皮质激素水平降低[32],脱氢表雄酮作为肾上腺激素,受促肾上腺皮质激素调节[33-34],这可能是导致本研究中脱氢表雄酮水平降低的主要原因.

本次研究中,17种二噁英同类物中氯数最少毒性最强的TCDD与类固醇激素无相关性,而氯数更多脂溶性更强的 12378-PeCDD、123678-HxCDD、1234678-HpCDD、OCDD、1234678-HpCDF与上述类固醇激素呈显著性相关(P＜0.05).这一结果与我们之前所作的关于母乳中二噁英暴露对其子代类固醇影响的研究结果相似,即氯数更多脂溶性更强的二噁英同类物与类固醇激素表现出更强的相关性[10,35].二噁英同类物对人体的毒性作用需要在今后做进一步的研究和讨论.

4 结论

4.1 二噁英暴露导致成年男性性激素睾酮(污染地区6263pg/mLvs非污染地区5309pg/mL)和雌二醇(污染地区 12ng/mLvs非污染地区10ng/mL)水平增高,可能诱发患前列腺疾病风险增高.

4.2 二噁英暴露导致成年男性脱氢表雄酮水平随年龄增长而降低趋势明显(污染地区 r=-0.3177vs非污染地区r= -0.1957),致快速衰老的风险增高.

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