抗肿瘤靛红衍生物的C-3羰基立体选择性还原与活性研究

赵 雪，郝思雨，彭小林，李学慧，吴 萌，陈文竹，孙 华

(天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

靛红又名二氢吲哚-2，3-二酮，在多种植物中广泛分布，如欧洲菘蓝(Isatis tinctoria)、虾脊兰(Calanthe discolor)、炮弹果(Couroupita guianensis)等[1]．近年来的研究显示，靛红衍生物在体内和体外可以抑制多种肿瘤，其中一些衍生物已经成功用于治疗癌症，包括长春碱(vinblastine)[2]、长春新碱(vincristine)[3]、舒尼替尼(sunitinib)[4]．其中，舒尼替尼又名SU11248，是一种口服的小分子多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，具有抑制肿瘤血管生成和抗肿瘤细胞生长的多重作用，是多个国家和地区晚期肾细胞癌的一线治疗药物[5]．

本课题组的前期研究[6]发现，靛红衍生物 HKL-2c具有良好的体外抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞的IC50达到40～70,nmol/L．因此，该化合物正在进行进一步衍生化，以期发现结构新颖且药理活性理想的靛红衍生物．目前，对于靛红衍生物 C-3羰基的区域选择性和立体选择性的还原，只有C-3羰基还原成3β-羟基的报道[7-8]，但对于还原成 3α-羟基尚未见报道．因此，为了进一步获得更多的衍生物用于活性筛选，本研究通过微生物催化的方法获得了3α-羟基的靛红衍生物．利用 X单晶衍射和核磁共振方法确定产物的结构，并进行体外抗肿瘤活性评价．

1 材料与方法

1.1 材料

D(+)-蔗糖、D(+)-葡萄糖、硝酸钠、硫酸镁、氯化钾、FeSO4·7H2O、磷酸氢二钾、无水硫酸钠、琼脂粉，分析纯，国药集团化学试剂有限公司．

康宁木霉(Trichoderma koningii)AS3.4290购自中国普通微生物培养物保藏中心(CGMCC)，保存于-20,℃的20%,甘油储备液中．

PRMI-1640细胞培养液、F12营养培养基、DMEM 低糖培养基、巴西胎牛血清、0.25%,胰蛋白酶(1×)溶液、青霉素-链霉素溶液，赛默飞世尔科技公司；噻唑蓝(MTT)，北京索莱宝科技有限公司；喜树碱，分析纯，北京偶合科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，美国 Amresco公司；本实验使用的靛红衍生物 HKL-2c由天津科技大学生物工程学院药物设计与合成研究室合成与保存．

TX323L型电子分析天平，岛津国际贸易有限公司；Model 3100,series型CO2培养箱、Multiskan MK3型基础酶标仪，赛默飞世尔科技公司；CKX41型奥林巴斯倒置显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司；TGL-20M 型高速台式冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；Vortex-6型漩涡混合器、LX-300型迷你离心机，海门其林贝尔仪器制造有限公司；YXQ-LS-50SI型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司；循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司；低温恒温反应浴，巩义市京华仪器有限公司；Av-400,MHz型核磁共振仪，瑞士 Bruker 公司；Rigaku Saturn CCD 单晶衍射仪，日本株式会社理学公司；ZWY-2102型回旋式恒温调速摇瓶柜，上海智城分析仪器制造有限公司；超净工作台，苏州净化设备厂；WS2-134-75 型电热恒温培养箱，天津市实验仪器厂．

1.2 微生物转化

1.2.1 康宁木霉AS3.4290培养基

斜面培养基(g/L)：马铃薯 200，葡萄糖 20，琼脂 20 ．

发酵培养基(g/L)：马铃薯 200，葡萄糖 20，磷酸二氢钾 3，硫酸镁0.2，碳酸钙0.2．

1.2.2 转化底物溶液的配制

将化合物 1(HKL-2c)用 DMSO溶解，质量浓度为100,g/L．

1.2.3 康宁木霉AS3.4290对化合物1的转化反应

将保藏菌种接种到 PDA斜面培养基上，30,℃恒温培养72,h，用接种环刮取菌落表面的孢子接种于含有 100,mL发酵培养基的 250,mL培养瓶中，30,℃、120,r/min 摇床培养 48,h．以 1%,的接种量转移到新鲜培养基中，30,℃、120,r/min 摇床培养24,h．加入底物溶液100,µL，使转化液中化合物1的质量浓度达到0.1,g/L，30,℃、120,r/min 继续培养 7,d，终止发酵．1.2.4 产物的分离纯化与结构鉴定

转化反应结束后抽滤分离菌丝体和发酵液．分别用乙酸乙酯萃取菌丝体和发酵液，振荡，重复 3次，合并萃取液，减压蒸发除去溶剂，得到转化产物的粗品．对粗转化产物进行硅胶柱色谱分离，石油醚与乙酸乙酯体积比分别为 100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1．产物用氯仿和己烷重结晶，得到化合物2，黄色结晶，产率为23%,．

1.3 醋酸酐乙酰化

化合物 2(100,mg，0.31,mmol)溶于乙酸酐(5,mL)中回流反应 2,h．冷却至室温后，反应液用乙酸乙酯(50,mL)稀释，有机相依次用饱和碳酸氢钠水溶液(50,mL)萃取 1次，饱和氯化钠水溶液(50,mL)萃取 2次．有机相用无水硫酸钠干燥，除去溶剂．对粗品进行硅胶柱色谱纯化(石油醚与乙酸乙酯体积比为5∶1)，得到化合物3，白色结晶，产率为98%,．

1.4 体外抗肿瘤活性的测定

分别取对数生长期的人慢性髓原白血病细胞K562、人肝癌细胞 HepG2和人结肠癌细胞 HT-29，用 0.25%,胰蛋白酶消化，以 5×104,mL-1细胞密度接种于 96孔培养板内，每孔 100,µL，置于 37,℃、5%,CO2培养箱孵育 24,h．靛红衍生物组(化合物 1—3)加药终浓度为 10,µmol/L、1,µmol/L、0.1,µmol/L、10,nmol/L、1,nmol/L．同时设置等体积 DMSO 溶剂对照组和阳性对照组(喜树碱)，每组设 3个平行孔．24,h后每孔加入药物 0.5,µL，溶剂对照组加入等体积DMSO．37,℃、5%,CO2培养箱孵育48,h后，每孔加入 MTT 20,µL，37,℃、5%,CO2培养箱继续孵育 4,h后终止培养．弃去培养基上清液，每孔加入 DMSO 100,µL，置于培养箱 10,min， 臜使甲 结晶充分溶解，酶标仪 492、630,nm 波长下测定吸光度，用 Graph Pad Prism 5.0软件计算药物对细胞生长的半数抑制浓度IC50值．

2 结果与分析

2.1 化合物1的生物转化与结构鉴定

课题组前期筛选了多种微生物，发现康宁木霉AS3.4290对化合物1的C-3羰基具有选择性还原能力．因此，利用康宁木霉对化合物 1进行了生物转化．对获得微生物转化的化合物 2纯品进行了质谱测试，相对分子质量为 322.2([M-H]-)，说明产物加了两个氢(化合物 1的相对分子质量为 321.3)，初步说明是还原产物．并对化合物 2进行了核磁共振氢谱和碳谱测试与分析，进一步确定了化合物2为还原产物，但难以确定还原的位置以及羟基的构型．

2.2 化合物2的乙酰化与结构鉴定

由于化合物 2易被氧化，稳定性较差，为了获得稳定的产物用于进一步结构解析，对化合物2的羟基进行了乙酰化，得到化合物 3(图 1)．对化合物 3首先进行了核磁共振和质谱测试，但仍难以确定 3-羟基的构型．因此，进一步获得了化合物 3的单晶，并进行了X单晶衍射测定，结构如图2所示，化合物的3位乙酰氧基为α-构型，从而推断出不稳定化合物 2的3-羟基为α-构型．

图1 HKL-2c的微生物转化与乙酰化Fig. 1 Biotransformation and acetylation of HKL-2c

图2 化合物3的单晶结构图Fig. 2 Single crystal structure of compound 3

2.3 化合物光谱数据

(S，E)-3-(1-苄基-3-羟基-2-羟基吲哚-5-基)丙烯酸甲酯(化合物 2)：1H NMR(400,MHz，CDCl3)3.78(s，3H)，4.89(s，2H)，5.22(s，1H)，6.33(d，1H，J＝16.0,Hz)，6.72(d，1H，J＝8.0,Hz)，7.27～7.37(m，6H)，7.62(d，1H，J＝16.0,Hz)，7.67(s，1H)．13C NMR(100,MHz，CDCl3)δ 44.0，51.7，69.5，109.7，116.4，124.2，127.3，127.3，127.6，128.0，128.9，128.9，129.8，130.9，134.8，144.1，144.7，167.5，177.0．ESI-MS 322.0 [M-H]-．

(S，E)-3-(3-乙酰氧基-1-苄基-2-氧代二氢吲哚-5-基)丙烯酸甲酯(化合物 3)：1H NMR(400,MHz，Acetone-d6)2.22(s，3H)，3.71(s，3H)，4.79(s，2H)，6.15(d，1H，J＝12.0,Hz)，6.71(d，1H，J＝8.4,Hz)，7.18～7.27(m，7H)，7.48(d，1H，J＝15.6,Hz)，7.60(d，1H，J＝8.0,Hz)．13C NMR(100,MHz，Acetone-d6)δ 19.6，43.9，50.7，109.5，109.5，116.2，127.1，127.1，127.1，127.2，127.2，128.5，128.5，128.5，131.7，135.5，143.7，146.3，166.5，169.3．ESI-MS 363.8 [M-H]-．

2.4 靛红衍生物体外抗肿瘤活性测定结果

以喜树碱为阳性对照，通过 MTT法检测化合物1—3对人源性肝癌细胞 HepG2、人源性结肠癌细胞HT-29、白血病细胞K562体外抗肿瘤活性，结果见表1．与化合物 1相比，化合物 2的抗肿瘤活性保持较好，而化合物3的活性有所下降，说明3位羰基或羟基是活性必需的．

表1 靛红衍生物 1—3抑制 K562、HepG2、HT-29细胞增殖的IC50值Tab. 1 IC50 of indole derivatives 1-3 inhibiting for K562，HepG2 and HT-29 cell proliferation

3 结 论

目前，对于靛红母核的还原只有利用硼氢化钠将C-3羰基还原成 3β-羟基的报道，但尚未见还原成3α-羟基报道．本研究通过微生物转化的方法，利用康宁木霉菌株获得了靛红类衍生物的 C-3羰基还原为 3α-羟基的产物，由于产物的不稳定性，利用其乙酰化产物间接确定了产物的结构，单晶衍射结果确证了羟基的绝对构型．其体外抗肿瘤活性测试表明，羰基还原为 3α-羟基后，抗肿瘤活性保持，对 3种肿瘤细胞株K562、HepG2和HT-29的抑制活性均高于阳性对照组．本研究为靛红类衍生物 3位羰基区域性和立体选择性还原开辟了新的方法，为该类化合物的衍生化和构效关系研究奠定了基础．

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