不同供水下白羊草(Bothriochloa ischaemum)离体根呼吸特征——基于稳定碳同位素示踪技术

刘 琦,李 鹏,刘 莹,肖 列,黄 鹏,汤珊珊

西安理工大学陕西省西北旱区生态水利工程国家重点实验室培育基地,西安 710048

土壤呼吸是生态系统碳循环的重要环节,作为大气CO2重要的来源和土壤碳库主要的输出途径,是陆地生态系统第二大碳通量,全球每年由土壤释放的CO2量为98 Pg[1],土壤CO2呼吸会显著加剧大气中CO2浓度的增高[2],加剧温室效应。植物根系是土壤C输入的主要途径[3-4],植物光合作用固定的碳量约50%由根呼吸释放[5-6],研究表明根呼吸占土壤呼吸的大部分,由根呼吸损失的碳占土壤碳释放量的40%—70%[7- 10],这表明研究根呼吸对揭示生态系统碳收支及生物圈碳平衡具有的重要意义。

目前,有学者研究发现土壤水分、温度、养分等环境因素可通过影响植物光合同化物的形成及其在叶、茎和根中的分配,进而影响根系形态和根系呼吸[11-12]。测量植物根呼吸的方法分为直接法和间接法,直接法包括离体根法、同位素法、PVC 管气室法等,间接法分环割法和根排除法,这些研究方法可得出根呼吸速率变化和根呼吸对土壤呼吸的贡献率[13- 15]。测定方法同样对根呼吸的估计存在差异性,如在对温带草原的研究中,同位素法和排除根法所测定的根呼吸对土壤总呼吸的贡献率分别为19%和39%[13,16]。稳定碳同位素13C脉冲标记技术是研究根系呼吸有机碳输入、输出的新方法,有着灵敏度高、扰动较小和理论上较合理等优点[17],可定量研究植物输入到根部的碳[18]和根际呼吸[19-20],但不能反应光合碳从地上传输到根系后的代谢过程,即根系中的碳在不同时间、不同供水条件下的呼吸释放过程少有研究,这是估算C平衡中的关键,需要相关研究支持。

白羊草(Bothriochloaischaemum),是多年生禾本科孔颖草属C4植物,为典型旱生植物,其繁殖能力快、再生能力强、耐踩踏、耐旱、区域适应性强,成为陕北黄土丘陵区生产力较高的草种,白羊草的根系发达呈网状,能拦截地表降雨有蓄水保土的作用,也是黄土高原退化草地恢复和C存储的重要植物之一。在干旱半干旱区水分胁迫是最普遍的环境胁迫,根系作为土壤和植物物质运移的交换器官[21],研究不同供水下根系对其的响应对揭示植物抗旱性本质有重要的意义[22]。测定离体根呼吸释放的CO2可研究离体根呼吸速率的变化规律[11],但不能说明光合碳运输至根系后的运移及释放过程,而土壤水分、根系形态及根组织养分含量等都可能影响离体根呼吸,因此本文采用稳定碳同位素脉冲标记方法,研究3种供水条件,供水充分(80%田间持水量,HW)、轻度胁迫(60%田间持水量,MW)和重度胁迫(40%田间持水量,LW)下,不同离体时间的白羊草离体根呼吸及其影响因素,为定量研究光合碳传输到根系后的呼吸释放过程及根系固碳提供新思路,以期为在不同水分条件下研究碳固定、代谢和估算提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设计

1.1.1 实验材料

(1)试验用土壤和种子情况

实验于2014年5月在西安理工大学进行。实验用土壤采于陕北黄土丘陵区以白羊草为优势种的草地,土壤类型为黄土,去除表层腐殖质和枯落物,取0—30 cm土壤均匀混合装袋,自然风干后过2 mm筛,同时测定其容重。实验用白羊草种子于2013年10月采于陕北未受人为影响的草地,采收后装在纸袋内自然状态下实验室储藏。实验为盆栽控制实验,采用自制有机玻璃容器,每盆装土2.5 kg,容重与陕北采土样地容重相同,为1.2 g/cm3;总N含量0.69 g/kg;田间持水量为22%。

(2)室内试验装置

自制有机玻璃容器：用于播种白羊草种子。采用透明有机玻璃制成长方体容器,尺寸为19 cm×4 cm×27 cm。底部打双孔,内径厚度为4 cm,共计需要上述花盆72个。

图1 双层密闭有机玻璃标记气室Fig.1 Double-layer sealed plexiglass labeled air chamber

自制双层密闭有机玻璃标记气室：用于测定土壤呼吸速率。采用透明有机玻璃制备的双层密闭有机玻璃罩长方体容器,内层尺寸为50 cm×50 cm×80 cm,四周及底部密闭,顶部开口,开口尺寸30 cm×30 cm,并配有尺寸相同的带密封条盖子;在玻璃罩相对两侧设置外层密闭槽,外层槽厚5 cm,上下密封,仅在上下各留2 cm直径的进出水口。玻璃罩另相对两侧设置直径为4 cm的进气口和出气口,采用相同尺寸橡胶塞密封,橡胶塞中部打孔,插入外径8 mm,内径6 mm导气管,上部进气口除插入导气管外,在橡胶塞中部还插入玻璃导液管,上述所有连接处均用凡士林密封,导气管连接仪器进气口和出气口。共计需要上述气室3个。如图1为实验时在自制双层密闭有机玻璃标记气室中对白羊草幼苗进行13C脉冲标记。

自制密闭根呼吸气室：用于测定离体根呼吸速率,采用透明有机玻璃制备的有机玻璃罩长方体容器,尺寸为20 cm×10 cm×20 cm,顶部及底部密闭,两侧开口,开口尺寸分别为直径为2 cm的圆孔和直径为4 cm圆孔,并配有尺寸相同的橡胶塞,橡胶塞中部插入外径5 mm,内径4 mm导气管,分别连接仪器的进气口和出气口。共计需要上述气室4个。

1.1.2 实验设计

种子于2014年5月1日播种,每个自制有机玻璃容器撒播5穴,出苗后每穴保留生长最旺盛的一株幼苗,未出苗的种穴进行补植。定苗后于2014年7月1日开始控水实验处理,设3个土壤水分梯度,供水充分(80%田间持水量,HW),轻度胁迫(60%田间持水量,MW),重度胁迫(40%田间持水量,LW);每个水分梯度设21盆重复;同时布设空白土壤样本9盆,每个水分梯度3盆重复。盆栽土壤含水量控制采用称重法,每天定时称重控制浇水,直至2014年10月1日实验结束。每盆白羊草生物量在控水处理前计入本底值重量,由于幼苗的初始生物量0.867 g与实验结束时每盆白羊草湿生物量最大值5.812 g差值仅占整体盆栽控水总重量3880 g的0.1%,且控水时间较短,因此忽略白羊草生长重量增加对水分处理控制的影响。

1.2 实验测定与方法

1.2.113C脉冲标记

标记于2014年9月13—15日9:00—12:00进行。每个水分处理随机选取12株白羊草幼苗,放在自制双层密闭有机玻璃标记气室内。同时标记室内放入盛有约2 g Na2CO3的小烧杯,烧杯顶部连接用于导入HCL的导液管和用于加标记气体的导气管,导液管和气管接至标记气室外侧(连接处密封)。采用CCIA- 36d-EP二氧化碳同位素质谱仪(Los Gatos Research,USA)监控标记室内CO2浓度、δ13C值。标记开始时,用针管注入丰度为99.9%13CO2气体,标记室内初始CO2浓度450 μmol/mol,δ13C值为5000‰,温度27—28℃。在标记过程中,标记气室内CO2浓度低于400 μmol/mol,用针管从外接导管入口注入1 mol/L HCL直至Na2CO3反应放出12CO2气体使标记气室CO2浓度达到450 μmol/mol,若δ13C低于5000‰,则由气管加入13CO2气体,重复此过程,直至实验结束。标记时间为120 min,标记结束时标记室内CO2浓度约为450 μmol/mol,δ13C值为4000‰。

1.2.2 样品采集与离体根呼吸测定

13C脉冲标记结束后0,6,24,48,216,360 h进行样品采集和离体根系呼吸测定。各处理未标记样品与标记后360 h样品同一天(2015年10月1日)按照上述方法采集。在上述采集时段,分别取各水分处理的白羊草幼苗3盆,手动将根系从土壤分离,用镊子收集根系,分离出的根系蒸馏水冲洗干净后用滤纸吸干水份,断口涂抹凡士林后立即放入连接LGR二氧化碳气体同位素质谱仪的自制根呼吸气室(采用高速测定模式,每秒记录一次数据),测定0—2 h根系呼吸速率,扫描根系后,将根系60℃恒温烘干48 h,称干重后粉碎,过0.149 mm筛备用。

1.2.3 样品稳定碳同位素及化学组分测定

(1)扫描与δ13C测定

将采集的根样立即用扫描仪 (Expression 1680, ETSON) 扫描, 再用根系图像分析软件(Win RHIZO TRON 2005a, Regent Instruments, Canada) 对根形态参数进行测定。比根长是根长与对应根长根系干重比值。取0.005—0.006 g植物根系样品采用MultiN/C3100德国耶拿总有机碳分/总氮分析仪(Analytik Jena AG,Germany)固体燃烧室中1050℃高温充分燃烧后生成CO2(同时记录样品TOC值g/Kg),之后采用二氧化碳同位素质谱仪检测样品的δ13C值。植物根系的δ13C值的测定以PDB(Pee Dee Belemnite)为标准,稳定碳同位素比值据下式计算：

式中,(13C/12C)PDB为标准物质PDB的13C/12C,δ13C表示样品13C/12C与标准样品偏离的千分率。

(2)N浓度测定

采用凯氏定氮仪(Kjeltec 2300,Foss Tecator AB,Sweden)测定根系组织N浓度。

1.3 资料分析

试验数据均采用Microsoft Excel 2013绘图,在SPSS 21.0中采用线性回归及单因素法分析根参数与根呼吸相关性。

2 结果

2.1 不同供水条件下离体根呼吸速率变化特征

如图2,3种供水条件下,不同根系离体时间的离体根呼吸速率在2 h内呈先急剧减小,略微增大后减小,之后趋于平稳的趋势。13C脉冲标记完成后0 h时离体,3种供水条件下根呼吸变化趋势相似：0—20 min急剧下降,HW、MW、LW依次下降32.80%、35.18%、33.82%,在60 min左右降至最低。分别在13C脉冲标记完成6,24,48,216,360 h时离体,3种供水条件下根呼吸速率在0—20 min均有急剧下降的趋势,下降百分比为32%—39%,各离体时间的根系呼吸速率均在60 min左右降到最低,其后变化趋于平缓。

图2 不同供水条件下离体根呼吸随呼吸时间的变化Fig.2 Changes of excised root respiration rates with respiration time under different water supply conditionsLW：重度胁迫,Low watered;MW：轻度胁迫,Middle watered;HW：供水充分,High watered

3种供水条件下,离体根呼吸速率在13C脉冲标记后0—48 h呈现波动性变化,48—216 h均呈现增大趋势,之后逐渐减小。离体根呼吸速率范围在300—450 μg g-1min-1(图3)。其中LW处理的根呼吸速率呈现双峰变化趋势,在标记后0 h时最低,为356 μg g-1min-1,6 h时达到第一个峰值413 μg g-1min-1;MW处理呈现单峰变化,0—48 h呈下降趋势,在48 h最小,为338 μg g-1min-1,216 h时达到峰值,为431 μg g-1min-1;HW处理在0 h时根呼吸速率最大,为419 μg g-1min-1,其后呈波动变化。

图3 不同供水条件下离体根呼吸随根离体时间的变化 Fig.3 Changes of excised root respiration rates with root excised time under different water supply conditions

2.2 不同供水条件下根呼吸释放的δ13C变化特征

根呼吸释放的δ13C测定的环境变化小,平均气室温度27—28℃,平均气室CO2浓度为400—450 μmol/mol。

3种供水条件下,经13C脉冲标记后,不同根离体时间的根呼吸释放的δ13C值在2h内呈先增大后减小的趋势(图4)。13C脉冲标记后0h离体,3种供水条件下白羊草离体根呼吸释放的δ13C值均小于-5‰,其中HW供水条件下根呼吸释放的δ13C均值最大;HW和MW处理的δ13C值约在0—70 min时呈逐渐上升趋势,在70 min时达到峰值后呈缓慢降低趋势;而LW处理的δ13C值则在45 min达到峰值。13C脉冲标记后6 h离体,根呼吸释放的δ13C值对比0 h略增,δ13C均为负值,变化趋势与0 h相似。13C脉冲标记后24 h离体,根呼吸释放的δ13C上升为正值,均值从大到小依次为HW>MW>LW。13C脉冲标记后48 h离体,根呼吸释放的δ13C对比之前的测定值,变化趋势有较明显改变,在LW和HW处理下根呼吸释放的δ13C值先均呈较快上升趋势,分别70 min和80 min达到峰值,其后逐渐下降;MW处理下δ13C值先缓慢上升,在80 min时达到峰值。13C脉冲标记后216 h离体,根呼吸释放的δ13C值与之前对比,HW和MW处理下δ13C值变化更为剧烈,且变化趋势和范围相近,在0—90 min内HW处理下δ13C值从10.94‰上升到38.92‰,MW处理下δ13C值从8.91‰上升到38.02‰,其后逐渐下降;LW处理下在0—50 min内从4.30‰上升到15.68‰,其后缓慢下降;其中HW处理下根呼吸释放的δ13C均值最大,比MW高8%,比LW高132%。13C脉冲标记后360 h离体,根呼吸释放的δ13C对比216 h的δ13C值有明显下降,HW处理下在100 min达到峰值19.64‰,MW处理下在90 min达到峰值16.60‰,LW在50 min达到峰值3.30‰;HW水分条件下根呼吸释放的δ13C均值最大,比MW高10%,比 LW高714%。总体上,HW和MW处理下的δ13C值比LW后达到峰值, HW处理下δ13C均值略高于MW,与LW差值较大。

图4 不同供水条件下根呼吸释放的δ13C随呼吸时间的变化Fig.4 Changes of δ13C released of root respiration with respiration time under different water supply conditions

3种供水条件下,根呼吸释放的δ13C随13C脉冲标记后离体时间的推移呈先增大后减小的趋势(图5)。3种供水条件下,13C脉冲标记后0—6 h,根呼吸释放的δ13C均为负值,标记后48 h出现拐点,根呼吸释放的δ13C值增长迅速,并均在216 h达到峰值,其中HW处理的根呼吸释放的δ13C值最大,为31.46‰,比0 h时增长了417.78%,其次为MW下根呼吸释放的δ13C,为31.46‰,比0 h时的δ13C增长了375.67%;再次是LW的δ13C值,为13.54,比0 h时增长了213.40%;标记后360 h离体测得,根呼吸释放的δ13C急剧降低。

2.3 不同供水条件下影响离体根呼吸的根参数特征

不同供水条件下根参数的特征不同(表1)。LW处理下白羊草的总根长和总根面积显著增加,其中总根长是HW处理总根长的2.86倍,是MW的2.60倍;总根面积约是HW和MW处理的2.7—3.0倍。对比3个水分处理下白羊草的比根长和比根面积发现,MW处理的比根长显著大于其他两个处理,但比根面积却没有显著差异。根C含量在各个水分处理均无显著性差异。根N含量随供水增加而增大,碳氮比随供水增加而减小,差异均不大。

表1 不同供水条件下白羊草根参数特征(平均值±标准误)

LW：重度胁迫,Low watered;MW：轻度胁迫,Middle watered;HW：供水充分,High watered;小写字母表示不同水分处理间差异显著(P<0.5)

2.4 不同供水条件下离体根呼吸与影响因子根参数的相关性

通过对白羊草离体根呼吸速率及根呼吸释放的δ13C影响因素做相关分析(表2)可知：在HW供水条件下离体根呼吸速率并未显著受到根系形态及养分因子的影响,根呼吸释放的δ13C与根系全氮呈极显著负相关关系。在MW供水条件下,离体根呼吸速率与根呼吸释放的δ13C、根组织δ13C三者间呈显著相关性,但这两个指标与根系形态及组织养分浓度并未表达出显著相关性。在LW供水条件下,离体根呼吸速率与根面积呈显著正相关性,与比根面积呈极显著正相关性;根呼吸释放的δ13C与根面积和C/N比均呈显著正相关。

表2 不同供水条件下白羊草根呼吸与根参数的相关关系矩阵

*表示根呼吸速率与对应影响因子相关性显著,**表示根呼吸速率与对应影响因子相关性极显著

图5 不同供水条件下根呼吸释放的δ13C随根离体时间的变化 Fig.5 Changes of δ13C released of root respiration with root excised time under different water supply conditions

3 讨论

3.1 实时13CO2变化监测对准确描述离体根系呼吸的意义

离体根法和13C同位素表示法是测定根呼吸的主要方法,而根呼吸是土壤呼吸的重要贡献之一[12],土壤呼吸CO2的释放是对植物光合碳转化和利用的表现[23]。本文中离体根呼吸速率在20 min内迅速下降(下降范围32%—39%)后短暂上升,之后继续下降,最后呼吸速率趋于平稳,这与李又芳等[24]对16年杉木细根、易志刚[15]对马尾松和黄果厚壳桂根系、Rakonczay等[25]对红花槭和赤栎、Bloom等[26]对大麦的根系的离体根呼吸研究得到的结果相似,造成这一现象的原因有以下两点：(1)细根离体后,有机物迅速分解,地上部分碳源不能及时供给,造成根系离体后呼吸速率急剧下降;(2)由于易分解有机物分解达到了相对稳定的状态,此时根损伤刺激根际微生物活动[27],微生物活动稍有加强,但可利用的碳源缺乏,微生物的活动导致了短时间内根呼吸速率波浪变化的趋势[28]。

通过对比前人研究我们发现,对于离体根系的CO2释放速率可描述根系离体后根系呼吸速率的总体变化趋势,但当说明植物光合碳在“大气-植物-土壤”系统随时间的分配过程和分配比例,尤其是光合产物从地上部分运送到植物根系后,根系部分光合碳随时间的释放过程无法采用离体根呼吸速率这一指针反映。本研究用13C脉冲标记示踪白羊草根系接收的光合碳,用离体根呼吸释放的δ13C研究根呼吸代谢能够解决上述问题。本研究表明：白羊草根呼吸释放的δ13C值随标记后离体时间(0—360 h)的推迟呈先增大后减小的趋势,在标记后第216 h离体测得的δ13C达到峰值。何敏毅等[29]对玉米光合碳分配研究表明根际呼吸产生的绝大部分13C都出现在标记后的216 h内,随时间推移13C积累速率降低,Wang等[30]研究表明内蒙古典型草原13C在地上叶片光合作用产生的标记光合同化物从叶片运输到地下根系,再由根系通过呼吸作用释放至大气需要约240 h,与本研究的结果一致,这说明本文提出的方法对于研究植物光合作用同化碳运输到根系,再以根呼吸形式释放的过程是可行的。

再者本文离体根呼吸释放的δ13C值也受到水分胁迫的影响,表现为：根呼吸释放的δ13C均值HW>MW>LW,当供水越充足,根呼吸释放的δ13C的峰值出现的越迟,且峰值越大,这与任军等[31]对不同供氮水平下水曲柳根呼吸、刘殿英等[32]对水分胁迫下的冬小麦根系、韦莉莉等[33]对杉木、严昌荣等[34]对暖温带落叶阔叶林生态系统主要乔灌木植物的光合作用产物及分配的研究结果相一致,当土壤含水量在一定阈值以下,根系呼吸速率随着土壤水分的增加而增大,干旱处理植株各组织平均δ13C值总低于正常供水,因为供水不足会降低根系对N的吸收能力,限制苗木各器官的生长,光合效应13CO2的吸收随之减小。以上研究表明此方法可以定量研究根系呼吸释放的碳及其释放特征,对定量估算植物光合产物向地下运输的C固定和C代谢关系提供新思路支撑。

3.2 不同水分下根参数对根固碳和呼吸的影响

本研究表明,在HW供水条件下,白羊草离体根呼吸释放的δ13C与根组织δ13C、根系全N呈极显著负相关关系,这可能是由于水分充足时,植株生长状况良好,地上部分光合固定的13C总量大,地下根系的固碳能力强,但土壤含水量大时根呼吸增强[35],植物生长(C固定)和根呼吸(C代谢)呈现竞争关系,此消彼长;另一方面根系对N的吸收能力随土壤水分增大而增强[32],水分充足时,根N含量增大,离体根呼吸释放的C量会随之增大[24],这与根系本身固碳也形成了竞争关系,所以水分充足时离体根呼吸释放的δ13C与根系全N呈极显著负相关关系。

在MW供水条件下,白羊草离体根呼吸速率,与根呼吸释放的δ13C和根组织δ13C呈显著正相关性,是由于植物受到轻度水分胁迫,促使根系生长[32,36-37],根系下扎, 深层根相对较多,根系具有较强的吸收能力, 可促进地上器官生长发育良好,而根干重、总吸收面积、光合强度等皆呈正相关关系[32],此时光合作用固定的总13C量增加,根呼吸释放和根组织δ13C量同时增加,轻度水分胁迫致使植物生长(C固定)和根呼吸(C代谢)同时增加。

在LW供水条件下,白羊草离体根呼吸速率与根组织δ13C、根面积、比根面积呈显著正相关性,由于重度水分胁迫下,根系生长追逐水源,竞争碳水化合物,同化产物多分配向根系[37],白羊草通过增加根长和根面积获取更多的土壤水分[38-39],而根系呼吸作用主要通过根表皮吸入O2和释放CO2[40],根面积的大小会直接影响根系的呼吸效率和呼吸量[31],所以重度水分胁迫引起输入到根系的光合碳比例增加,根组织δ13C增大,根面积的增大又导致呼吸作用增强,它们之间呈现正相关性。重度水分胁迫下,根呼吸释放的δ13C与C/N呈显著正相关性,重度水分胁迫导致根系对N的吸收能力降低[32],植物为了获取足够的氮来保证其生长, 一般通过提高向根系分配更多的碳量来促进根系的生长,目的是达到提高氮吸收能力, 也提高了根系的呼吸速率[41],这与Eissenstat和Yanai[42]提出的成本-效益(cost-benefit)理论一致,碳作为成本,在重度水分胁迫下,植株对根系的光合碳投入比例增大,根系对N的吸收能力弱导致C/N大,根呼吸释放的δ13C增加,根系固碳量小。

本文只研究稳定碳同位素脉冲标记后光合产物在根系的释放及固定过程,后期可定量分析植物从叶片吸收光合作用产物后的运移及释放的整体过程,研究植物光合C在“大气-植物-土壤”系统随时间的分配和分配比例。

4 结论

1)3种供水条件下,不同根离体时间的白羊草离体根呼吸速率在2h内的无显著差异,且变化趋势一致, 0—20 min急剧下降,下降百分比为32%—39%,反映了根呼吸的速率水平。

2)稳定性碳同位素13C脉冲标记后,用根呼吸释放的δ13C研究离体根呼吸,实时监测转移到白羊草根系的13CO2在根部呼吸释放的过程。3种水分条件下,根呼吸释放的δ13C在2 h内均值大小为：供水充分>轻度胁迫>重度胁迫。随离体时间(0—360 h)推迟根呼吸释放的δ13C均值先增大后减小,在216 h达到峰值31.46‰。

3)3种供水条件下,离体根呼吸速率和根呼吸释放的δ13C受根系根面积、比根面积、N含量、C/N及根组织δ13C的影响显著。

4)轻度水分胁迫可促使根系生长(C固定)和根呼吸(C代谢)同时增加。

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