4种木兰属植物花粉萌发特性

俞 芹，王倩颖，王宁杭，王型力，范李节，张明如，申亚梅

（浙江农林大学 风景园林与建筑学院，浙江 杭州 311300）

木兰属Magnolia植物分布范围广，多为高大乔木或灌木，抗性强，株型优美，早春季节开花，花色艳丽，具有较高的观赏价值，在园林绿化中应用广泛［1］，具有广阔的市场价值。目前，杂交育种是木兰属新品种选育的主要手段之一，大部分种间杂交均表现为亲和［2］。花粉活力的高低直接影响杂交育种工作的成败。花粉活力的测定方法有直接授粉、离体萌发、染色法等［3］。直接授粉花粉生活力易受柱头可授性、授粉时期、花粉与柱头亲和性等因素影响［4］。根据染色原理不同，染色法分为氯化三苯基四氮唑（TTC）、碘－碘化钾法、联苯胺法、醋酸洋红染色法等，该方法虽简单易操作，但所测得的花粉活力受花粉自身特性的影响较大，如花粉壁的厚度、花粉内各种酶活性的强弱等［5］，未成熟、衰老或败育的花粉仍能染色［6］。离体培养法为花粉提供的条件与花粉在柱头内萌发的条件相似［7］，所得花粉活力与花粉在柱头上的活力最接近，是检测花粉活力的最佳方法。近年来，已有许多木兰属植物花粉形态、生活力及其储藏特性的相关研究， 如二乔玉兰Magnolia soulangeana［8］， 天女木兰 Magnolia sieboldii［9］， 紫玉兰Magnolia liliflora［10］，景宁木兰Magnolia sinostellata［11］等，研究表明不同植物适宜的培养基组分及质量浓度要求不同，花粉离体培养中所需的萌发条件也不同。本研究在综合前人研究的基础上，以望春玉兰Magnolia biondii，长花玉兰 Magnolia ‘Changhua’，丹馨玉兰 Magnolia ‘Danxin’，黄山木兰 Magnolia cylindrica等为试验材料，研究不同培养基组分、培养温度及时间对花粉萌发的影响。旨在筛选出各植物材料适宜的培养基及花粉萌发最佳条件，为木兰属植物的育种工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

望春玉兰、长花玉兰、丹馨玉兰、黄山木兰等4种木兰属植物均来自于浙江农林大学苗圃地，将所采集花药置于硫酸纸上，自然干燥24～36 h，待花药开裂后收集花粉，并放置于硅胶中干燥，－80℃条件下储藏备用。

1.2 试验设计

1.2.1 单因子试验 采用离体培养法。蔗糖质量浓度梯度为0，50，100，150，200 g·L－1；硼酸质量浓度梯度为 0， 50， 100， 200， 300 mg·L－1； PEG-4000 质量浓度梯度为 0， 150， 200， 250， 300 g·L－1。

1.2.2 正交试验 在单因子试验的基础上，选取对试验材料影响较大的培养基组分及质量浓度，进行L9（33）正交试验（表1），以得到最佳培养基组分。

1.2.3 最佳培养条件的确定 利用最佳培养基，把4种试验材料分别置于15，20，25，30，35℃下进行离体培养，培养12 h后，根据实验结果，确定最适萌发温度。在最适温度条件下，分别培养3，6，9，12，15 h，确定最佳培养条件。

1.3 试验方法

采用离体培养法，在双凹载玻片内滴入培养液，将充分混匀后的花粉均匀点入培养液中，将载玻片置于铺有湿润滤纸的培养皿内，25℃，8 400 lx人工气候培养箱中培养12 h。在显微镜下观察统计，花粉管长度等于或超过花粉粒直径的花粉即视为已萌发。重复3次·处理－1，观察视野3个·重复－1，所统计的花粉粒不少于50粒·视野－1。花粉萌发率=（萌发的花粉粒数/视野中花粉粒总数）×100%。

1.4 数据处理

使用Excel 2010对数据进行统计，利用SPSS 22.0对原始数据进行反正弦转换并进行单因素方差分析（Duncan’s），各处理间差异显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同培养基组分对4种木兰属植物花粉萌发的影响

2.1.1 蔗糖对花粉萌发的影响 试验结果表明：不同质量浓度蔗糖对4种木兰属植物花粉萌发率影响显著（图1A）。随着蔗糖质量浓度的增加，4种花粉萌发率均呈先增加后减小的变化趋势。不同植物最大萌发率及最适蔗糖质量浓度有所不同，望春玉兰花粉适宜的蔗糖质量浓度为50和100 g·L－1，花粉萌发率分别为62.56%和68.87%，显著高于其他质量浓度处理下的萌发率（P＜0.05）；当蔗糖质量浓度超过100 g·L－1时，望春玉兰花粉萌发率下降，但蔗糖溶液中花粉萌发率均高于对照。长花玉兰在100 g·L－1的蔗糖溶液中，萌发率达最大，为18.02%，显著高于其他质量浓度处理（P＜0.05）；蔗糖质量浓度为200 g·L－1时，花粉萌发率最低，为9.90%，比对照低1.92%。在各质量浓度蔗糖培养基上，丹馨玉兰花粉萌发率均低于10%，蔗糖质量浓度为0～100 g·L－1时，花粉萌发率差异不显著（P＞0.05）；而高质量浓度蔗糖溶液对丹馨玉兰花粉萌发起抑制作用，150和200 g·L－1蔗糖质量浓度下，花粉萌发率显著低于对照，分别降低了3.47%和4.42%。黄山木兰花粉适宜的蔗糖质量浓度为50～100 g·L－1，在此范围内花粉萌发率显著高于对照（P＜0.05），在200 g·L－1蔗糖溶液中，黄山木兰花粉萌发率最低，为2.46%，低于对照22.95%。

2.1.2 硼酸对花粉萌发的影响 硼酸对4种木兰属植物花粉萌发均有显著作用（图1B）。其中，望春玉兰花粉在200 mg·L－1硼酸的培养液中萌发率高达79.63%，显著高于其他质量浓度下花粉的萌发率（P＜0.05），且比对照萌发率高46.89%，高质量浓度的硼酸培养液中花粉萌发率与对照无显著差异（P＞0.05）。在0～200 mg·L－1硼酸范围内，长花玉兰花粉萌发率均随质量浓度的增加而上升，其最适质量浓度为200 mg·L－1，萌发率为25.57%，显著高于对照；在300 mg·L－1硼酸条件下，萌发率开始下降。丹馨玉兰花粉在各质量浓度硼酸条件下萌发率差异均不显著（P＞0.05），当硼酸质量浓度为50和100 mg·L－1时，花粉萌发率达最大，分别为13.22%和14.93%，对照萌发率最低，为7.27%。黄山花粉萌发率随着硼酸质量浓度增大而增加，在100 mg·L－1时，其花粉萌发率达最大，为47.09%，显著高于200 mg·L－1下的萌发率（28.47%），与其他质量浓度培养液中的花粉萌发率差异不显著（P＞0.05）。

2.1.3 PEG-4000对花粉萌发的影响 随着PEG-4000质量浓度的增加，4种木兰属植物花粉萌发率均呈先增加后减小的变化趋势（图1C）。PEG-4000的质量浓度为200和250 g·L－1时，望春玉兰花粉萌发率达最大，分别为53.92%和51.21%，显著高于其他质量浓度处理（P＜0.05）。长花玉兰花粉萌发的最适PEG-4000质量浓度为150 g·L－1，之后随着PEG-4000质量浓度的增加，花粉萌发率降低；当质量浓度为300 g·L－1时，花粉萌发率仅为2.41%，显著低于对照萌发率（13.60%）。可见高质量浓度的PEG-4000抑制长花玉兰花粉萌发。丹馨玉兰花粉在PEG-4000质量浓度为150～250 g·L－1时，萌发率差异不显著（P＞0.05）， 显著高于其他处理（P＜0.05）；质量浓度为 200 g·L－1时萌发率最大，为 17.29%； 300 g·L－1PEG-4000抑制花粉萌发，萌发率仅为2.41%，且低于对照（4.39%）。在150g·L－1PEG-4000培养液中黄山木兰花粉萌发率达最大（42.39%），显著高于其他质量浓度下花粉萌发率，随着质量浓度增大，萌发率呈逐渐递减趋势。

图1 不同因素对4种木兰属植物花粉萌发率的影响Figure1 Effects of different factors on pollen germination rate of four Magnolia species

2.2 4种木兰属植物花粉最佳萌发培养基的选择

在单因子试验的基础上，进行L9（33）正交试验，寻找最佳培养基组合。试验结果表明（表1）：4种木兰属植物花粉萌发对液体培养基组分的质量浓度存在差异，这可能因不同基因型花粉自身的萌发特性而异。 望春玉兰在 50 g·L－1蔗糖＋50 mg·L－1硼酸＋200 g·L－1PEG-4000 培养基下萌发率高于其他培养基，高达69.23%，极差分析表明各因素对其花粉萌发率的影响依次为：硼酸＞蔗糖＞PEG-4000。长花玉兰在 100 g·L－1蔗糖＋200 mg·L－1硼酸＋200 g·L－1PEG-4000 培养基下萌发率最高， 为 51.47%， 极差分析显示对其花粉萌发率的影响因素依次为：蔗糖＞PEG-4000＞硼酸。丹馨玉兰在100 g·L－1蔗糖＋100 mg·L－1硼酸＋150 g·L－1PEG-4000培养基下萌发率最高，为29.79%，极差分析显示对其花粉萌发率的影响因素依次为： 蔗糖＞硼酸＞PEG-4000。 黄山木兰在 50 g·L－1蔗糖＋100 mg·L－1硼酸＋250 g·L－1PEG-4000 培养基下萌发率最高，为69.54%，极差分析表明各因素对其花粉萌发率的影响依次为蔗糖＞硼酸＞PEG-4000。

表1 4种木兰属植物花粉正交试验的萌发率Table 1 Pollen germination rate of four Magnolia species in orthogonal design experiment

2.3 4种木兰属植物花粉萌发最适条件

2.3.1 最适培养温度 不同温度对望春玉兰、长花玉兰、丹馨玉兰及黄山木兰花粉萌发率均有一定的影响（图3A）。15～25℃内，随着温度的升高，萌发率随之增加，25℃时各植物花粉萌发率显著高于其他温度处理萌发率（P＜0.05），依次为75.85%，31.85%，18.94%，61.14%；在25～35℃内，随着温度的上升，萌发率受到抑制，即温度过高或过低均不适合4种花粉萌发。由此可见：虽然4种不同遗传背景的花粉萌发率有较大差异，但其最适萌发温度相同。

2.3.2 最适培养时间 由试验结果可知（图3B）：培养3 h时，4种木兰属植物花粉均已萌发，6～9 h萌发率迅速上升，12～15 h萌发率趋于稳定。其中培养9 h时，望春玉兰和黄山木兰花粉萌发率达到最大，分别为71.19%和59.82%，而长花玉兰和丹馨玉兰花粉萌发率在培养12 h时达到最大，分别为44.50%，23.43%。4种植物花粉虽最适培养时间有所不同，但其萌发趋势几乎一致。

图2 不同培养条件下4种木兰属植物花粉萌发率的变化Figure 2 Changes of different culture conditions on pollen germination rate of four Magnolia species

3 结论与讨论

蔗糖和硼酸是组成花粉离体培养基的基本成分，蔗糖为花粉代谢、跨膜运输等过程提供必要的能量，同时也是维持花粉内环境稳定的渗透调节物质［12］。本研究结果表明，蔗糖对4种木兰属植物花粉萌发的影响水平不同，蔗糖在长花玉兰、丹馨玉兰及黄山木兰花粉萌发中具有主导作用，但对望春玉兰花粉萌发率影响水平次于硼酸，这可能与不同植物生物学特性相关。4种木兰属植物花粉萌发最适蔗糖质量浓度（50～100 g·L－1）与二乔玉兰［8］， 天女木兰［9］结果相符。

硼元素在植物体内作为微量营养生长调节剂，以花器官内含量居多，且主要分布于柱头及子房，硼对糖分的吸收具有促进作用，参与果胶物质的合成，且促进花粉管壁的形成，从而加快花粉萌发生长［13］。本研究中，4种木兰属植物所需最适硼酸质量浓度不同，但在含有硼酸的培养基中花粉萌发率均高于对照，即花粉萌发需要硼元素的参与。正交试验结果表明：望春玉兰花粉萌发所需硼酸质量浓度低于其他3种花粉，可能由于蔗糖和PEG-4000的添加，望春玉兰花粉对硼酸的需求量减少。长花玉兰在200 mg·L－1硼酸溶液中萌发率达最大，与景宁木兰研究结果相同［11］；丹馨玉兰、黄山木兰均在100 mg·L－1硼酸溶液中萌发率达最大，与二乔玉兰、天女木兰结果一致［8－9］。由此可知：100～200 mg·L－1硼酸可促进木兰属植物花粉萌发生长。

PEG-4000作为高分子渗透剂，在花粉萌发过程中，通常改变花粉内膜结构，提高内膜通透性，从而促进花粉粒萌发［14］。单因素试验表明：4种木兰属植物最适PEG-4000质量浓度为150～250 g·L－1，对蜡梅Chimonanthus praecox［15］的研究发现，低质量浓度PEG-4000对花粉离体萌发作用不显著，而高浓度下，花粉萌发率显著受到抑制，本研究结果与此相一致。正交试验结果表明：PEG-4000在4种花粉萌发中均不是主导因子，而若蜡梅花粉离体培养基内不含PEG-4000，其花粉不萌发［15］，可能由于不同科植物花粉萌发过程中所需营养不同。PEG-4000是首次应用于木兰属植物花粉离体萌发，对同属其他植物花粉萌发有待进一步研究。

多数花粉萌发的最适温度为25℃［16］，本研究结果与此相同。也有研究发现［17］：由于植物分布区不同，其花粉萌发对温度的响应有所差异。望春玉兰和黄山木兰花粉在培养9 h时萌发率达最大，而长花玉兰和丹馨玉兰花粉最佳培养时间为12 h，在各自最适培养时间下，对花粉其进行观察，花粉管互不交错，清晰，便于统计。

4 参考文献

［1］王子华，潘玉霞，李庆有，等.木兰属植物育种研究进展［J］.河北科技师范学院学报，2011，25（4）：40－44.WANG Zihua,PAN Yuxia,LI Qingyou,et al.Research progress in breeding of Magnolia genus plant ［J］.J Hebei Norm Univ Sci Technol,2011,25（4）:40 － 44.

［2］王亚玲，李勇，张寿洲，等.木兰科植物的人工杂交［J］.武汉植物学研究，2003，21（6）:508－514.WANG Yaling,LI Yong,ZHANG Shouzhou,et al.The crossing result of Magnoliaceae ［J］.J Wuhan Bot Res,2003,21（6）:508 － 514.

［3］张超仪，耿兴敏.6种杜鹃花属植物花粉活力测定方法的比较研究［J］.植物科学学报，2012，30（1）：92－99.ZHANG Chaoyi,GENG Xingmin.Comparative study on methods for testing pollen viability of the six species from genus Rhododendron ［J］.Plant Sci J,2012,30（1）:92 － 99.

［4］胡春，刘左军，李富香，等.钝裂银莲花花粉活力测定方法的研究［J］.植物研究，2013，33（5）：582－586.HU Chun,LIU Zuojun,LI Fuxiang,et al.Detection methods for pollen viability of Anemone obtusiloba ［J］.Bull Bot Res,2013,33（5）:582 － 586.

［5］苏芸芸，王康才，薛启.不同产地藿香花粉活力与柱头可授性研究［J］.草业学报，2016，25（9）：189－196.SU Yunyun,WANG Kangcai,XUE Qi.Study of the pollen viability and stigma receptivity of Agastache rugosa from different areas ［J］.Acta Pratac Sin,2016,25（9）:189 － 196.

［6］李梅，周兰英.云南松花粉储藏温度及离体萌发条件［J］.浙江农林大学学报，2017，34（1）：63－67.LI Mei,ZHOU Lanying.Storage temperature and pollen viability of Pinus yunnanensis ［J］.J Zhejiang A＆F Univ,2017,34（1）:63 － 67.

［7］管雨，贾文庆，刘会超，等.木瓜花粉生活力测定及储藏特性［J］.浙江农林大学学报，2012，29（5）：790－794.GUAN Yu,JIA Wenqing,LIU Huichao,et al.Pollen viability and storage of Chaenomeles sinensis ［J］.J Zhejiang A＆F Univ,2012,29（5）:790 － 794.

［8］张亚利，田振坤，刘燕.二乔玉兰花粉贮存条件的比较研究［J］.热带亚热带植物学报，2006，14（4）：318－320.ZHANG Yali,TIAN Zhenkun,LIU Yan.Preservation methods of pollen of Magnolia soulangeana Soul.-Bod. ［J］.J Trop Subtrop Bot,2006,14（4）:318 － 320.

［9］王子华，张风娟，秦素平，等.天女木兰花粉形态特征及其生活力［J］.热带亚热带植物学报，2008，16（6）：551－556.WANG Zihua,ZHANG Fengjuan,QIN Suping,et al.Pollen morphology and viability of Magnolia sieboldii［J］.J Trop Subtrop Bot,2008,16（6）:551 － 556.

［10］刘会超，贾文庆，郭艳艳.紫玉兰花粉的生活力测定及贮藏方法［J］.贵州农业科学,2011,39（7）:188－191.LIU Huichao,JIA Wenqing,GUO Yanyan.The determination of Magnolia liliiflora pollen viability and its storage method ［J］.Guizhou Agric Sci,2011,39（7）:188 － 191.

［11］卢璐，余泽智，刘雪燕，等.景宁木兰花粉萌发与贮藏特性研究［J］.植物研究，2014，34（2）：182－187.LU Lu,YU Zezhi,LIU Xueyan,et al.Pollen germination and storage of Magnolia sinostellata ［J］.Bull Bot Res,2014,34（2）:182 － 187.

［12］叶要妹，张佳祺，张双凤，等.百日草自交系花粉萌发条件及花粉活力研究［J］.华中农业大学学报，2007， 26（5）： 693 － 696.YE Yaomei,ZHANG Jiaqi,ZHANG Shuangfeng,et al.In vitro pollen germination of inbred lines of Zinnia elegans Jacq.［J］.J Huazhong Agric Univ,2007,26（5）:693 － 696.

［13］胡珂雪，张晓曼，郑云凤.四季报春花粉萌发特性研究［J］.西北林学院学报，2017，32（2）：170－173.HU Kexue,ZHANG Xiaoman,ZHENG Yunfeng.Characteristics of pollen germination of Primula obconica ［J］.J Northwest For Univ,2017,32（2）:170 － 173.

［14］赵宏波，房伟民，陈发棣.梅花花粉离体萌发和花粉管生长研究［J］.广西植物，2007，27（3）：393－396.ZHAO Hongbo,FANG Weimin,CHEN Fadi.Pollen germination in vitro of Mei flower ［J］.Guihaia,2007,27（3）:393－396.

［15］龚双姣，马陶武，刘强.培养基组分及培养条件对蜡梅花粉萌发及花粉管生长的影响［J］.西北植物学报，2012， 32（6）： 1254 － 1260.GONG Shuangjiao,MA Taowu,LIU Qiang.Effects of culture medium composition and culture conditions on pollen germination and pollen tube growth of Chimonanthus praecox ［J］.Acta Bot Boreal-Occident Sin,2012,32（6）:1254－1260.

［16］彭向永，刘俊祥，李振坚，等.蒿柳花粉离体萌发及花粉管生长特性［J］.北京林业大学学报，2017，39（3）：81－86.PENG Xiangyong,LIU Junxiang,LI Zhenjian,et al.Characteristics of pollen germination and pollen tube growth in Salix viminalis in vitro ［J］.J Beijing For Univ,2017,39（3）:81 － 86.

［17］郭磊，张斌斌，马瑞娟，等.温度对桃离体花药散粉及花粉萌发的影响［J］.植物生理学报，2014，50（3）：269－274.GUO Lei,ZHANG Binbin,MA Ruijuan,et al.Effects of temperature on the pollen dissemination and germination of peach ［J］.Plant Physiol J,2014,50（3）:269 － 274.