不同脏腑虚损对慢性阻塞性肺疾病患者病情及线粒体功能的影响＊

张少华，徐 丹，闫雪娇，金 晶，荆 晶，姜 敏，李 争，高 振，李风森,5＊＊

（1.新疆医科大学中医学院 乌鲁木齐 830000；2.新疆国家中医临床研究基地COPD研究室 乌鲁木齐 830000；3.新疆医科大学附属第一医院中医科 乌鲁木齐 830000；4.新疆医科大学附属中医医院呼吸病理生理实验室 乌鲁木齐 830000；5.新疆医科大学附属中医医院呼吸科 乌鲁木齐 830000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种常见的、可以预防和治疗的疾病，以持续呼吸道症状和气流受限为特征，通常是由于明显暴露于有害气体与颗粒引起的气道和/或肺泡异常所导致的[1]。线粒体普遍存在于真核细胞（成熟红细胞除外），是细胞进行有氧呼吸的主要场所，细胞生命活动所需的能量大约95%来自线粒体，被喻为人体的“能量工厂”。研究[2，3]证实COPD患者存在线粒体功能障碍，有大量外文文献[4]认为线粒体参与了气道重塑促进了COPD的发生。现代医学多认为，COPD是气道或肺组织暴露于有害气体环境而致病，近年来也逐渐认识到宿主因素在发病中的重要作用。中医理论认为脏腑虚损在COPD的发病中发挥了重要作用，正虚积损为COPD的主要病机[5]。本文通过横断面调查的方法探讨脏腑虚损对COPD病情的影响，发现随着脏腑虚损程度越来越重COPD病情也越来越重，具有肺脾肾三脏虚损特征的COPD病情表现最重；通过流式细胞术检测不同脏腑虚损COPD患者外周血有核细胞线粒体功能，发现具有脾虚特征的COPD患者存在线粒体功能障碍，推测补脾疗法可能改善线粒体功能障碍。现将研究结果报告如下：

1 资料与方法

1.1 研究对象

2016年1月至2017年10月在新疆医科大学附属中医医院呼吸科门诊就诊的稳定期COPD患者共161名。

1.1.1 纳入标准

①志愿受试者，依从性好；②年龄40-80岁；③符合西医诊断标准的COPD稳定期患者；④符合中医脏腑虚损标准。

1.1.2 排除标准

①COPD急性加重期患者；②合并支气管哮喘、支气管扩张、气胸、间质性肺病、胸腔积液、肺癌、活动性肺结核等其他严重肺部疾病的患者；③合并有严重心脑血管、肝肾和造血系统等原发性疾病患者；④精神病患者；⑤妊娠或哺乳期妇女；⑥合并肿瘤患者；⑦先天或后天性免疫缺陷者；⑧近1个月内参加过其它临床试验的患者。

1.1.3 诊断标准

（1）COPD的诊断

参照“GLOBAL INITIATIVE FOR CHRONIC OBSTRUCTIVE LUNG DISEASE 2016版”[1]制定。根据临床表现、危险因素接触史、体征及实验室检查等资料综合分析确定。考虑COPD的主要症状为慢性咳嗽、咳痰和（或）呼吸困难及危险因素接触史；存在不完全可逆性气流受限是诊断COPD的必备条件。肺功能测定指标是诊断COPD的金标准。用支气管舒张剂后FEV1/FVC＜70%可确定为不完全可逆性气流受限。凡具有吸烟史及(或)环境职业污染接触史及（或）咳嗽、咳痰或呼吸困难者均应进行肺功能检查。COPD早期轻度气流受限时可有或无临床症状。胸部X线检查有助于确定肺过度充气的程度。

（2）COPD稳定期的诊断（参照GOLD2016修订版）

患者咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或症状轻微。一般来说，患者持续4-6周症状稳定，未出现急性加重，即为稳定期。

（3）脏腑虚损诊断标准

依据中华中医药学会制定的《中医内科常见病诊疗指南-中医病证部分（2008版）》肺胀（ZYYXH/T4-49-2008）[6]和《慢性阻塞性肺疾病中医诊疗指南（2011版）》[7]制定：

肺气虚：①咳嗽和喘息、气短，动则加重；②神疲、乏力或自汗；③恶风，易感冒；④舌质淡、苔白，脉沉细或细弱。具备①和②、③、④中的2项即可诊断。

脾气虚：①不欲食，纳呆或食少；②胃脘胀满或食后胀甚或便溏；③神疲乏力，少气懒言，自汗，动则加重；④舌体胖大或有齿痕，舌苔薄白或腻，脉沉细活沉缓或细弱。具备①和②中的1项，加中③、④的1项。

肾气（阳）虚：①腰膝酸软，神疲乏力；②男子滑精早泄，女子月经淋漓不尽；③耳鸣，头昏或面目虚浮；④小便频数清长，夜尿多，或咳而遗尿；⑤舌质淡，舌苔白，脉沉细或细弱。具备①、②中的1项加③、④、⑤中的1项。

一般来说，同时具备肺气虚和脾气虚者为肺脾气虚，同时具备肺气虚和肾气（阳）虚者为肺肾气虚，同时具备肺气虚、脾气虚和肾气（阳）虚者为肺脾肾虚。

1.2 患者信息采集

记录患者人口学信息及病史资料，采用COPD评估测试量表（CAT）[8]、呼吸困难量表（mMRC）[9]对患者进行评分、进行六分钟步行试验（6MWT）[10]。

1.3 线粒体实验

采集外周静脉血约2 mL，红细胞裂解液（武汉博士德公司，批号：12F29C18）处理抗凝全血，裂解液工作浓度为细胞湿体积的3-5倍，置冰上操作约5-10 min至红细胞裂解完全，期间需摇动混悬均匀，700 g 4℃离心弃上清提取有核细胞。PBS洗涤细胞沉淀1-2次制作细胞悬液，JC-1（美国sigma公司，批号：MKBX5979V）、DCFH-DA（南京建成公司，批号：20170331）染色，JC-1存储液浓度为1 mg·mL-1（JC-1 1 mg，溶于二甲基亚砜1 mL），DCFH-DA存储液浓度为10 mmol·L-1。具体染色方法：1 μL JC-1存储液加入500 μL细胞悬液中；DCFH-DA 工作浓度为 10 μmol·L-1，1 μL DCFH-DA存储液加入PBS1 mL制作工作液，取约500 μL工作液加入适量细胞沉淀重悬，37℃孵育30 min上流式细胞仪（Guava easyCyte 8HT，Merck Millipore公司）检测，细胞悬液浓度不超过500 cells/μL，guavaSoft 2.7分析流式数据。

1.4 质量控制

中医辨证结论不能取得一致时双人再次核对并由中级职称以上中医师把关。肺通气功能检查采用日本产Chest HI-101型，测试质量控制达到A、B级。（参阅中华医学会肺功能指南2014版）[11]。

表1 不同脏腑虚损COPD患者性别比较（卡方检验）

表2 不同脏腑虚损COPD患者mMRC比较（秩和检验）

1.5 统计分析

采用SPASS21.0数据统计软件，计数资料采用卡方检验、计量资料符合正态分布方差齐采用单因素方差分析；相关性分析采用Pearson，不符合条件用非参数检验。

2 实验结果

2.1 患者一般资料

按照中医脏腑虚损标准，161例患者辨证为肺气虚者36例、肺脾气虚31例、肺肾气虚50例、肺脾肾虚44例。患者年龄分布：肺脾肾虚组＞肺肾气虚组＞肺脾气虚组＞肺气虚组，组间差异无显著性（P=0.101），但两两比较肺气虚组与肺脾肾虚组差异有显著性（P=0.014）；性别分布经卡方检验各组间差异不具有显著性（P=0.198），男女比率约为2∶1；身高在肺脾气虚组表现最低，另外3组差异不明显，4组间差异不具显著性（P=0.429）；体重在肺脾气虚组、肺脾肾虚组明显减少，但4组间差异经统计学检验不具显著性（P=0.384）；病程在肺脾气虚组最长，肺气虚组最短，4组间差异不具显著性（P=0.503）。不同脏腑虚损COPD患者基线数据组间差异可参阅统计表1、表2。

2.2 不同脏腑虚损COPD患者病情比较

COPD患者mMRC经秩和检验组间差异有统计学意义（P=0.001）。肺功能FVC%在肺脾气虚组最低，在肺气虚组最高，但4组间差异不具有显著性（P=0.265）；FEV1%在各组间差异具有显著性（P=0.025，两两比较P值见表2.2）；CAT在各组间差异具有显著性（P=0.001，两两比较P值见表2.2），6MWD在4组间差异不具显著性（P=0.057），但肺气虚组与肺脾、肺脾肾虚组比较差异具有显著性（P＜0.05）；FEV1%、FVC%、6MWT均值在肺脾肾虚组最低，CAT均值在肺脾肾虚组最高（表3）。

2.3 不同脏腑虚损COPD患者外周血有核细胞线粒体功能比较

104例患者完成了线粒体实验，线粒体膜电位采用红、绿荧光细胞百分比，细胞内活性氧（ROS）取平均荧光强度MFI进行统计计算。肺脾气虚组线粒体膜电位与肺气虚组、肺肾气虚组比较差异有显著性（P＜0.05）；肺脾气虚组细胞内活性氧与肺气虚组、肺肾气虚组比较差异有显著性（P＜0.01）；肺气虚组与肺肾气虚组线粒体膜电位、细胞内活性氧无明显差异。膜电位在肺脾气虚组明显降低，活性氧在肺脾气虚组明显升高；线粒体膜电位与活性氧存在相关性（相关系数0.223，P=0.021）。Pearson相关性分析显示膜电位与活性氧相关系数0.223，P=0.021（表4）。

2.4 基线数据及各观察指标统计图

从图1可以看出，脏腑虚损对病情的影响由单一肺气虚，发展为肺脾、肺肾两虚，进而三脏俱虚，FVC%、FEV1%、6MWT越来越低，CAT越来越高。线粒体膜电位在肺脾气虚组最低，细胞内活性氧在肺脾气虚组最高。

3 总结与讨论

现代医学认为COPD主要危险因素是吸烟，空气污染和生物燃料暴露也参与了该病的发生，除了环境暴露宿主因素也是COPD发生的另外一个重要因素[1]。中医理论认为，邪之所奏，其气必虚。正气存内，邪不可干，病焉从来？人体自身抗病能力降低，不能抵御外邪才致疾病缠绵不愈[12]。本研究发现，随着脏腑虚损程度越来越重，COPD的病情也越来越重。COPD脏腑虚损由单一肺气虚，发展为肺脾、肺肾两虚，进而三脏俱虚。本研究结果显示，肺脾、肺肾两脏虚损相比较，肺脾气虚证在FVC%、6MWD、CAT评分比肺肾气虚更重且病程在肺脾气虚组最长，说明肺脾气虚较之肺肾气虚病势更为缠绵。虽然，肺脾气虚证COPD缠绵难愈，但是，肺脾肾三脏虚损病情更为焦灼。研究数据显示，COPD的病情总体表现在肺脾肾三脏虚损患者是最重的。FEV1%在客观上反应了COPD患者的气道阻塞程度，CAT则在主观上反应了患者的病情，显示了逐级演变的过程。COPD病之标在肺，病之本在脾更在肾。肾为先天之本，脾为后天之本。肾藏元阴元阳，肾阳不足不能温煦脾阳，脾阳不足则痰浊内生，阻塞肺窍。肾阴不足，虚火上炎灼伤肺络。内经云：女子五七阳明脉衰，面始焦，发始坠；男子五八肾气衰，发坠齿稿。COPD发病多在40岁以后，这与内经描述的人肾气衰退的时间节点是吻合的。本研究发现，具有肾虚特征的COPD患者占比58.38%，也说明了肾虚在COPD发病中的重要作用。

表3 不同脏腑虚损COPD患者FEV1%、FVC%、CAT、6MWD比较(xˉ±s)

图1 各证型线粒体膜电位和细胞内活性氧平均荧光强度

线粒体呼吸链在利用氧产生ATP的同时也产生了大量的活性氧（ROS），导致线粒体DNA的损伤，Carpagnano等[13]发现MtDNA/nDNA的比率在COPD患者中显著高于正常对照组。线粒体DNA损伤后可引起呼吸链有关蛋白质亚单位合成障碍，形成有缺陷的呼吸链。线粒体跨膜电位则是一种反映细胞受损效应较灵敏的指标，受到损伤后膜电位就会降低［14］。本研究发现，在肺脾气虚组患者外周血有核细胞活性氧明显升高、膜电位明显降低，也证实了部分COPD患者存在明显线粒体功能障碍。通常线粒体跨膜电位和ATP水平的升高表明线粒体功能增强，能量供应充足，动能增加，细胞、组织运动能力加强［15］。鉴于线粒体与运动的相关性，刘友章［16］从骨骼肌活动基本形式探讨了“脾主肌肉”的病理生理机制，认为中医脾的功能与线粒体的功能非常近似，从某种程度上说线粒体就是“脾”的重要组成部分，脾主肌肉亦是通过线粒体的功能来实现的。本研究数据显示，FVC%、6MWD在肺脾气虚组明显下降，可能与呼吸肌、骨骼肌线粒体功能障碍，ATP供给不足有关。综合本研究各组数据来分析，可以看出肺脾气虚组患者是最有特点的一类，似乎脾虚对COPD病情的贡献度最大。本研究发现具有脾虚特征的COPD患者存在线粒体功能障碍，推测补脾疗法可能改善线粒体功能障碍，为COPD患者线粒体功能障碍的治疗提供了方向。

1 GOLD Committee.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease(Revised 2016).www.goldcopd.com.2016.

2 Lacedonia D,Carpagnano G E,Crisetti E,et al.Mitochondrial DNA alteration in obstructive sleep apnea.Respir Res,2015,16(1):47.

3 Pieters N,Koppen G,Smeets K,et al.Decreased mitochondrial DNA content in association with exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons in house dust during wintertime:from a population enquiry to cell culture.PLoS One,2013,8(5):e63208.

4 Rowlands D J.Mitochondria dysfunction:A novel therapeutic target in pathological lung remodeling or bystander?Pharmacology&Therapeutics,2016,166:96-105.

5 李建生.正虚积损为慢性阻塞性肺疾病的主要病机.中华中医药杂志,2011,8(26):1710-1713.

6 中华中医药学会.中医内科常见病诊疗指南,中医病症部分.北京:中国中医药出版社,2008:11-13.

7 李建生,李素云,余学庆.慢性阻塞性肺疾病中医诊疗指南(2011版).中医杂志,2012,53(1):80-84.

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10 American Thoracic Society.ATS statement：guidelines for the six-minute walk test.Am J Respir Crit Care Med,2002,166:111-117.

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12 李建生,余学庆,王明航,等.中医治疗慢性阻塞性肺疾病研究的策略与实践.中华中医药杂志,2012,6(27):1607-1612.

13 Carpagnano G E,Lacedonia D,Malerba M,et al.Foschino-Barbaro.Analysis of mitochondrial DNA alteration in new phenotype ACOS.BMC Pulmonary Medicine,2016,16:31.

14 韩磊,李鸣皋,马贵喜,等.血管紧张素-2对内皮细胞和线粒体跨膜电位影响.中国公共卫生,2009,25(1):51.

15 宋晓冬,刘孟安,孙丰润,等.中药胃肠舒对胃肠平滑肌细胞ATP生成的影响.世界华人消化杂志,2007,15(30):3162.

16 刘友章,刘江凯,弓淑珍,等.中医“脾主肌肉”与骨骼肌舒缩运动中能量代谢关系的探讨.江苏中医药,2009,41(4):5.