HBV宫内垂直传播与母体、胎儿HBeAg的关系及胎盘CD35表达的研究

刘彩丽，李岚，王颖瑛，史雨玉

(安阳市妇幼保健院检验科，河南 安阳 455000)

慢性乙型肝炎是世界上最常见的传染病之一，乙肝病毒的传染性比引起艾滋病的HIV病毒强100倍。中国是乙型肝炎的高发地区，乙肝病毒的持续感染造成乙肝慢性化，继发肝硬化，肝细胞癌。乙肝母婴垂直传播是重要的传播方式之一，在未给予干预的情况下，HBV母婴垂直传播比例高达90%，包括宫内传播、产时传播以及产后传播。宫内传播与胎盘屏障受损或者通透性增强引起母血渗漏有关。产时传播是母婴传播的主要途径，在分娩过程中子宫收缩使胎盘绒毛破裂，母血进入胎儿循环，或者在胎儿经过产道时，吞咽含有HB-sAg的母血、羊水、阴道分泌物，导致感染。分娩过程中的感染以及产后传播机制明确，可通过缩短分娩时间，人工喂养等方式干预，预防传播。目前宫内传播机制仍然是研究的热点，也是有效阻断垂直传播的关键。国内的研究显示，HBsAg高滴度，HBeAg阳性，HBV DNA高滴度，先兆早产是宫内传播的危险因素[1，2]。本文探讨宫内垂直传播与胎儿HBeAg的关系及胎盘CD35表达水平，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1月-2017年6月HBsAg阳性的孕妇121例为研究对象，根据新生儿脐血HBeAg结果分为HBeAg阳性组（58例）以及HBeAg阴性组（63例），另选择HBsAg阴性孕妇分娩50例为对照组。纳入标准：单胎，足月产，孕妇血清其他类型肝炎以及TTV均为阴性；无先兆早产、先兆流产、妊娠期高血压、其他感染性疾病病史；肝肾功能无异常；孕期未接受免疫调节剂、抗病毒药物、细胞毒性药物、激素类药物治疗；未合并免疫系统疾病；胎儿发育正常。孕妇丈夫非HBV携带；孕妇年龄、孕次、产次、胎龄、分娩方式等一般资料匹配（P＞0.05）。见表1。本研究经过医院医学伦理委员会同意。

1.2 材料、仪器以及试剂 HBV血清学标志物ELISA试剂盒（上海双赢生物科技有限公司）；人细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-6 ELISA试剂盒（北京同立海源生物科技有限公司）；HBV PCR荧光定量检测试剂盒 （安徽达健医学科技有限公司）。酶标仪，PCR扩增仪，37℃恒温箱，Ependorff管，洗板机，微量加样枪。1%盐酸酒精溶液，各浓度酒精，二甲苯，石蜡，甘油蛋白粘片剂，中性树胶，鼠抗人CD35（北京爱博生生物技术有限公司），自配EDTA，DAB染色试剂盒，PBS液。切片机，恒温箱，包埋纸盒，显微镜。

表1 三组一般资料比较

1.3 检测项目及方法

1.3.1 标本采集以及检测项目 产前采集孕妇静脉血 4ml，4℃保存，6h 后离心，3000rpm，10min， 取上清，进行HBV血清学标志物检测以及HBV DNA检测。分娩时，无菌条件下采集新生儿脐静脉血5ml。2ml用于检测血清HBV标志物以及HBV DNA。定量检测，余离心后取血清，分装于EP管中，-70℃保存， 检测 IL-2、IL-4、IL-6 以及 IFN-γ水平。胎盘娩出后，检查无肉眼病理改变，生理盐水清洗，分为4个象限，每个象限取1×1×2.0cm3大小中央带全层，多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，待测胎盘CD35表达水平。

1.3.2 检测方法 ⑴采用双抗夹心酶联免疫吸附法检测血清HBV标记物。⑵采用实时荧光定量PCR方法检测HBV DNA。⑶采用ELISA方法测定细胞因子IL-2、4、6以及IFN-γ。所有操作严格按照说明书进行。⑷胎盘CD35表达检测：石蜡切片脱蜡，放入3%双氧水-甲醛液中浸泡，消除内源性过氧化酶，PBS冲洗3次，每次2min，抗原修复，吸干液体后，每张切片加10%山羊血清适量，覆盖组织，孵育10min，吸干液体，用PBS液1：50比例稀释鼠抗人CD35，每张切片加适量一抗，覆盖至，4℃过夜。PBS液冲洗3次，每次2min，吸干液体，加抗小鼠生物素化二抗，覆盖组织，孵育10min，PBS冲洗3次，每次2min，吸干液体，加HRP标记的链亲和素，覆盖组织，孵育10min，PBS冲洗3次，每次2min；加DAB显色液，室温下2-15min显色，显微镜下观察显色程度，自来水冲洗，苏木素复染1min；梯度酒精脱水，二甲苯透明化处理，封片，镜检。阳性：CD35表达在红细胞、白细胞细胞膜，少量在细胞浆，棕黄色。

1.4 分析方法 统计121例新生儿发生宫内垂直感染的例数。胎儿宫内垂直感染判断：脐血HBsAg阳性或者HBV DNA阳性，未接种乙肝疫苗前股静脉血HBsAg阳性或HBV DNA阳性。分析孕妇HBeAg阳性、新生儿脐血HBeAg阳性、孕妇HBV DNA阳性者宫内感染率。比较三组脐血细胞因子水平。分析孕妇HBeAg与新生儿HBeAg阳性的相关性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 15.0统计学软件分析数据，计数资料采用卡方检验，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，采用 F 检验或 t检验，相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生儿宫内垂直传播发生率 121例新生儿，16例发生宫内垂直传播，感染率13.2%。发生宫内垂直传播新生儿HBsAg均为阳性，HBeAg阳性14例，占87.5%；新生儿HBV DNA阳性4例，占25.0%。孕妇HBeAg阳性、新生儿HBeAg阳性以及孕妇HBV DNA阳性宫内感染率见表2。孕妇HBeAg阳性宫内感染率显著高于阴性，新生儿HBeAg阳性者宫内感染率显著高于阴性者，孕妇HBV DNA阳性者宫内感染率显著高于阴性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 孕妇HBeAg阳性、新生儿HBeAg阳性以及孕妇HBV DNA阳性宫内感染率

2.2三组脐血细胞因子水平比较 见表3。HBeAg阳性组新生儿脐血IL-2、INF-γ水平显著下降，IL-4及IL-6显著升高，与HBeAg阴性组及对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。HBeAg阴性组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 三组脐血细胞因子水平比较（pg/ml）

2.3 孕妇HBeAg阳性与新生儿HBeAg阳性的关系 见表4。孕妇65例HBeAg阳性，其中55例新生儿HBeAg阳性，相关性分析显示两者有显著正相关的关系（r=0.791）。

表4 孕妇HBeAg阳性与新生儿HBeAg阳性的关系

2.4 胎盘组织CD35表达结果 共选择HBsAg阳性的孕妇10例的胎盘检测胎盘CD35，结果显示，CD35主要表达在绒毛膜毛细血管的红细胞膜，部分有核细胞有表达，而人胎盘滋养层、间质细胞中无CD35表达。提示CD35在血细胞上表达，而人胎盘各层组织中不表达。

3 讨论

既往对于HBV宫内垂直传播主要的研究是HBV通过胎盘途径感染，孕妇血中病毒通过感染胎盘组织，从胎盘逐层最终传递给胎儿[3]。胎盘对胎儿有保护作用，在胎盘血管未发生破裂的情况下，病毒需要逐层感染胎盘的各层结构才能最终达到胎儿。大量的研究证实胎盘不同细胞病毒感染率自母体面至胎儿面呈逐渐下降的趋势，但宫内传播危险性却逐渐升高，并且胎盘各层感染率、宫内感染率随着妊娠周数增加而增加[4]。胎盘组织中 可 检 测 到 HBsAg，HBeAg、HBV DNA 以 及HBcAg等标志物，证实HBV可感染胎盘并在滋养层细胞中复制，发生病理改变，最终导致胎儿感染[5]。HBV进入细胞后，HBsAg刺激细胞产生相应抗体，HBsAb的Fc片段可激活补体系统，形成抗原-抗体-补体复合物，如果胎盘组织有相应受体表达，则可结合复合物，使HBV逐层传递[6]。CD35是补体C3受体。HBV在胎盘上以HBsAg-抗HBs-补体C3形式存在。补体C3受体CD35是单链膜结合蛋白。在本次研究中，胎盘滋养层细胞以及间质细胞并不固有表达CD35，说明HBV在胎盘进行传播时，可能并不通过HBsAg抗原-抗体-补体-补体受体途径。

机体接触病毒后是否感染以及感染后病情发展与免疫状况密切相关，Th细胞是免疫应答的中心枢纽，Th1细胞与Th2细胞维持机体细胞免疫以及体液免疫的功能[7]。如果Th1或Th2细胞某一个亚群功能升高，一个受到抑制，导致机体免疫平衡的破坏。IL-2、INF-γ主要由Th1细胞分泌，主要诱导细胞免疫；IL-4及IL-6主要由Th2细胞分泌，诱导体液免疫。正常情况下机体Th1细胞与Th2细胞保持动态平衡，维持机体正常的免疫反应。而机体Th1/Th2的动态平衡是有效清除病毒以及病毒感染细胞的主要因素[8]。IL-2可刺激T细胞生长，促进B细胞增殖、分化，抗体产生，增强巨噬细胞等功能，抵御HBV感染。INF-γ可增强细胞免疫，增强巨噬细胞、中性粒细胞、活化NK细胞功能，可以在那转录后水平抑制HBV。IL-4调节体液免疫，对B细胞、巨噬细胞、T细胞有免疫调节作用，抑制Th1细胞因子表达。IL-6可诱导急性期蛋白合成，促进干细胞坏死，促进HBV感染，与肝癌、慢性肝炎的发生有关。在本次研究中，HBeAg阳性的新生儿IL-2、INF-γ水平下降，IL-4及IL-6水平升高，提示HBeAg可能抑制了胎儿Th1细胞分泌，促进了Th2细胞的分泌，机体细胞免疫受到抑制，促进HBV的感染[9]。分析结果也显示HBeAg阳性的新生儿宫内垂直感染率高于阴性的新生儿。

HBeAg是HBV传染性强弱的标志，既往的研究证实HBV DNA阳性，母体HBeAg阳性、新生儿HBeAg阳性是宫内垂直感染的高危因素[10-13]。本次的研究结果显示，母体HBeAg阳性与新生儿HBeAg阳性具有正相关的关系，母体HBeAg阳性增加了新生儿HBeAg阳性率。HBeAg有结合与游离两种形式，而结合状态的HBeAg能自由通过胎盘，到达胎儿血液循环，这与胎盘组织上过表达HBeAg-抗HBe-补体复合物受体有关，在其作用下介导HBeAg通过胎盘，进入胎儿血液循环[14，15]。在本次研究中也证实这母体HBeAg阳性者，新生儿HBeAg阳性率也更高，并且母体HBeAg阳性者宫内垂直感染率更高。孕妇HBV DNA阳性者新生儿宫内垂直感染率也显著高于阴性，与既往研究结果相似。有3例孕妇HBeAg阴性者而新生儿HBeAg阳性，可能与宫内感染后，新生儿自身产生相应抗原。

综上所述，孕妇HBeAg阳性与新生儿HBeAg阳性显著正相关的关系；新生儿HBeAg阳性者宫内感染率更高；HBV宫内垂直传播的新生儿存在机体免疫失衡；人胎盘滋养层、间质细胞中无CD35表达，提示HBV在胎盘进行传播时，可能并不通过HBsAg抗原-抗体-补体-补体受体途径。

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