TNF-α对类风湿性关节炎患者滑膜成纤维细胞RUNX3表达的影响及意义

王春亮，王林，潘继红

(济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，济南250062)

滑膜成纤维样细胞是类风湿性关节炎的主要效应细胞。类风湿性关节炎患者成纤维细胞增殖能力升高、凋亡能力降低[1,2]。TNF-α可促进破骨细胞的活化与骨吸收，并诱导其他炎性因子、黏附分子以及骨与软骨相关蛋白酶表达，从而引起滑膜衬里层增厚、骨及关节软骨破坏，进一步加剧关节炎症反应[1]。Runt相关转录因子3(RUNX3)属于Runt相关转录因子家族，包括RUNX1、RUNX2、RUNX3三个家族成员，均拥有高度保守的RD(runt domain)结构域。研究认为，RUNX3与溃疡性结肠炎密切相关[3]。全基因组关联分析研究显示，RUNX3的单核苷酸多态性遗传易感位点与强直性脊柱炎、银屑病、银屑病性关节炎、乳糜泻、过敏性皮肤炎、克罗恩氏病、哮喘等疾病有关[4]。但其在类风湿性关节炎发病中的作用却鲜见报道。为此，我们于2016年10月～2017年11月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 ①关节滑膜组织：选择山东省医学科学院学术合作单位山东省立医院骨科收治的、拟行膝关节置换术的类风湿性关节炎患者39例(男16例、女23例，平均年龄60岁)，术中采集其滑膜组织标本39例份。本研究通过山东省医学科学院伦理委员会审核，患者及家属均知情同意。②主要试剂：Ⅱ型胶原酶(Solarbio，中国)；人源RUNX3基因腺病毒(Vigene，美国)，GFP对照腺病毒(Vigene，美国)，助感染试剂(Vigene，美国)；siRUNX3(锐博，中国)，Hiperfect转染试剂(Qiagen，德国)；TRIzol Reagant(Invitrogen，美国)，SYBR(康为世纪，中国)，ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo，日本)。

1.2 成纤维细胞分离及原代培养 采用含1%双抗的Hank′s平衡盐溶液冲洗类风湿性关节炎滑膜组织5 次，将绒毛状纤维组织用高压灭菌剪刀剪下，置于无菌培养皿中充分剪碎。适当加入DMEM高糖培养基与Ⅱ型胶原酶(体积比为100∶4)混合液约3 mL，混匀后37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育6 h。加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-无EDTA的消化液，反复吹打至匀浆；70 μm细胞筛网过滤，1 500 r/min离心5 min。弃上清，将下层细胞沉渣吹打均匀后接种于含10% FBS和1%青链霉素双抗的DMEM培养基(以下称完全培养基)中，待细胞贴壁80%左右时除去悬浮的细胞。根据细胞状态进行换液和传代，采用自然纯化法和反复贴壁法纯化细胞，取传3～8代细胞用于后续实验。

1.3 TNF-α对成纤维细胞RUNX3表达的影响 采用实时荧光定量PCR法。取传3～8代的成纤维细胞，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-无EDTA的消化液消化5 min，离心去上清，完全培养基重悬细胞。将细胞接种至24孔板，调整细胞密度为(3～5)×104/孔。待细胞贴壁后，移弃培养基，加入TNF-α，调整其终浓度为0、0.1、1、10、50 ng/mL。分别于作用0、3、6、12、24 h，采用TRIzol法提取细胞总RNA，ReverTra Ace qPCR RT Kit反转录合成cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测不同浓度TNF-α作用后细胞RUNX3相对表达量，严格按照试剂盒说明书操作。RUNX3上游引物：5′-TGTTCTGGATGCTCTTGTGC-3′，下游引物：5′-GCACTGAAAGAGGACATGAGC-3′；内参GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反应体系10 μL；SYBER Green(荧光染料)5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，双蒸水2 μL，cDNA 1 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共45个循环。采用2-ΔΔCt法计算RUNX3 mRNA相对表达量。

1.4 TNF-α对过表达RUNX3的成纤维细胞炎性因子表达影响的观察

1.4.1 细胞分组处理 取传3～8代成纤维细胞接种于24孔板，调整细胞密度为(3～5)×104/孔，将细胞随机分为RUNX3过表达组和对照组。RUNX3过表达组和NC对照组分别感染人源RUNX3腺病毒、绿色荧光蛋白(GFP)对照腺病毒，MOI=50，浓度均为1.0×1010pfu/mL。加入1 μL助转染试剂及稀释10倍的腺病毒原液2.5 μL，调整终体积为500 μL。两组作用12 h左右更换新鲜培养液继续培养，作用24 h两组均加入50 ng/mL TNF-α再刺激24 h。

1.4.2 炎性因子表达检测 取1.4.1中TNF-α作用24 h的两组细胞，采用实时荧光定量PCR法(参照1.3的方法)检测两组IL-6、前列腺素E2(PGE-2)、趋化因子CXC基序配体9(CXCL-9)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)及基质金属蛋白酶13(MMP-13)表达。IL-6上游引物：5′-TGTAGCATGGGCACCTC-3′，下游引物：5′-CAGTGGACAGGTTTCTGAC-3′；PGE-2上游引物：5′-TGCGTTCAGTCCTCTGT-3′，下游引物：5′-CAGGAAGTTTGTGTTGCATC-3′；CXCL-9上游引物：5′-ATCTCTCCAACCAGATTGTCA-3′，下游引物：5′-TATTAGGCACTGTGGAAGAAAC-3′；MMP-2上游引物：5′-GTGCCTATTACCTGAAGCTG-3′，下游引物：5′-ATTTGATGCTTCCAAACTTCAC-3′；MMP-13上游引物：5′-AATATGTAGTATCTATATGACTATGCGT-3′，下游引物：5′-TTACTCTAACATTCTTCAATGTGGTTC-3′。

1.4.3 细胞侵袭能力检测 采用Transwell侵袭实验。Transwell小室置于24孔板中，将成纤维细胞按(3～5)×104/孔接种于小室中，参照1.4.1的方法进行分组处理。下室加入500 μL DMEM培养基(10%血清+1%青链霉素双抗)，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，上下室均换成DMEM培养基(无血清+1%双抗)对细胞进行饥饿处理，置于细胞培养箱6～8 h，将下室换成DMEM培养基(20%血清+1%双抗)，置于细胞培养箱中培养24 h。培养结束后用预冷的PBS清洗3次，浸泡于4%多聚甲醛中4 ℃固定过夜，室温下用瑞氏-吉姆萨染液染色6 h，预冷的PBS清洗2次。用一次性棉棒轻轻擦除小室上方细胞，镜下观察穿膜细胞数。

1.5 TNF-α对低表达RUNX3的成纤维细胞炎性因子表达的影响

1.5.1 细胞分组处理 取传3～8代成纤维细胞接种于24孔板，调整细胞密度为(3～5)×104/孔，将细胞随机分为RUNX3沉默组和对照组。RUNX3沉默组将5 μL siRUNX3和4 μL Hiperfect转染试剂加入到100 μL DMEM无血清无抗高糖培养基中，混合静置10 min后吸取100 μL转移至24孔板中，调整终体积为500 μL，siRUNX3终浓度为200 nmol/L。对照组采用同样的方法加入5 μL NC-control siRNA。作用24 h两组均加入50 ng/mL TNF-α再刺激24 h。

1.5.2 炎性因子表达检测 参照1.4.2的方法采用实时荧光定量PCR法检测RUNX3沉默组和对照组IL-6、PGE-2、CXCL-9、MMP-2及MMP-13表达。

2 结果

2.1 经不同浓度TNF-α作用后成纤维细胞RUNX3表达比较 成纤维细胞RUNX3 mRNA相对表达量随着TNF-α浓度升高及作用时间延长而逐渐升高，呈浓度和时间依懒性，以TNF-α浓度50 ng/mL、作用时间24 h时RUNX3 mRNA相对表达量上调最为显著(P均<0.05)。见表1。

表1 经不同浓度TNF-α作用后成纤维细胞RUNX3mRNA相对表达量变化

2.2 RUNX3过表达组和对照组细胞侵袭能力及细胞各炎性因子表达比较 RUNX3过表达组和对照组穿膜细胞数分别为(56±4)、(20±3)个，两组比较P<0.01。两组各炎症因子mRNA相对表达量比较见表2。

表2 两组各炎性因子mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 RUNX3沉默组和对照组各炎性因子表达比较 见表3。

3 讨论

研究认为，成纤维细胞在类风湿性关节炎发病的各个阶段均具有重要作用。类风湿性关节炎发病过程中一旦成纤维细胞被激活，将产生一系列炎性因子及细胞外基质降解酶等介导炎症反应，引起骨与软骨的进行性破坏[5，6]。TNF-α为重要的炎性因子，可促进成纤维细胞活化与增殖，从而参与类风湿性关节炎的病变过程。RUNX3家族成员有RUNX1、RUNX2及RUNX3，三者高度同源，其部分功能可能是重叠的，既往研究通过全基因组关联研究分析确定RUNX1是类风湿性关节炎的风险基因之一[7]；RUNX3与银屑病、银屑病性关节炎及强直性脊柱炎等自身免疫疾病相关[8]。本研究推测RUNX3可能也作为类风湿性关节炎的一个风险基因参与类风湿性关节炎病变过程。本研究结果显示，成纤维细胞RUNX3 mRNA相对表达量随着TNF-α浓度的升高及作用时间的延长而逐渐升高，呈浓度和时间依懒性，以TNF-α浓度50 ng/mL、作用时间24 h时成纤维细胞中RUNX3 mRNA相对表达量上调最为显著。提示随着病变关节处TNF-α等炎性因子的逐步积累，RUNX3表达也随之上调，高表达的RUNX3可能是炎性因子介导的长期慢性类风湿性关节炎的一个必要条件。

表3 两组各炎性因子相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

MMP-13属于基质金属蛋白酶家族成员中的胶原酶亚型[9,10]，对Ⅱ型胶原的降解作用最强，从而使胶原网状结构受到破坏，导致原本被细胞外基质包埋的软骨细胞暴露于炎性因子的攻击之下，并与细胞侵袭能力密切相关。MMP-13启动子区存在RUNX3结合位点[11]，因此我们认为成纤维细胞中RUNX3可能通过结合MMP-13启动子区而调控其表达。本研究结果显示，RUNX3过表达组穿膜细胞数明显多于NC对照组，说明上调RUNX3表达可促进成纤维细胞侵袭。IL-6参与成纤维细胞信号转导，可促进炎症相关细胞及破骨细胞分化，并将其募集到相关关节处[12～14]。本研究结果显示，上调成纤维细胞RUNX3后加入TNF-α刺激可显著上调IL-6、PGE-2、MMP-13表达，而沉默RUNX3后加入TNF-α刺激可显著下调IL-6、MMP2、CXCL-9和MMP-13表达。RUNX3调控共同的炎性因子为IL-6和MMP-13；推测IL-6可能是RUNX3除MMP-13之外的另一个下游靶分子，RUNX3可通过直接上调IL-6表达促进关节炎症反应，从而推动类风湿性关节炎进展。本研究RUNX3过表达组和对照组CXCL-9、MMP-2 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义，RUNX3沉默组和对照组PGE-2 mRNA相对表达量比较无统计学差异。因此推测，RUNX3对成纤维细胞细胞侵袭能力的影响可能与PGE-2、CXCL-9、MMP-2无关。

综上所述，TNF-α可促进成纤维细胞中RUNX3表达，并呈浓度和时间依懒性；RUNX3表达升高可促进成纤维细胞的细胞侵袭能力，其机制可能与调控MMP-13、IL-6表达有关。

参考文献：

[1] Davis JM 3rd,Matteson EL. My treatment approach to rheumatoid arthritis[J]. Mayo Clin Proc,2012,87(7):659-673.

[2] Smith HS,Smith AR,Seidner P. Painful Rheumatoid Arthritis[J]. Pain Physician,2011,14(1):427-458.

[3] Lotem J,Levanon D,Negreanu V,et al. RUNX3 at the interface of immunity,inflammation and cancer[J]. Biochim Biophys Acta,2015,1855(2):131-143.

[4] Alarcón-Riquelme ME. Role of RUNX in autoimmune diseases linking rheumatoid arthritis,psoriasis and lupus[J]. Arthritis Res Ther,2004,6(4):169-173.

[5] Firestein GS. Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Passive responders or transformed aggressors[J]. Arthritis Rheum,1996,39(11):1781-1790.

[6] Tolboom TCA,van der Helm-Van Mil AH,Nelissen RG,et al. Invasiveness of fibroblast-like synoviocytes is an individual patient characteristic associated with the rate of joint destruction in patients with rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheum,2005,52(7):1999-2002.

[7] Amamoto K,Kada Y,Uzuki A,et al. Genetic studies of rheumatoid arthritis[J]. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biot Sci,2015,91(8):410-422.

[8] Fu D,Song X,Hu H,et al. Downregulation of RUNX3 moderates the frequency of Th17 and Th22 cells in patients with psoriasis[J]. Mol Med Rep,2016,13(1):4606-4612.

[9] Siebert S,Tsoukas A,Robertson J,et al. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases[J]. Pharmacol Rev,2015,4(67):280-309.

[10] Wang M,Sampson ER,Jin H,et al. MMP13 is a critical target gene during the progression of osteoarthritis[J]. Arthritis Res Ther,2013,15(5):1-11.

[11] Chen Y,Wei X,Guo C,et al. Runx3 suppresses gastric cancer metastasis through inactivation of MMP9 by upregulation of TIMP-1[J]. Int J Cancer,2010,129(1):1586-1598.

[12] Yoshida Y,Tanaka T. Interleukin 6 and rheumatoid arthritis[J]. Biomed Res Inter,2014,1155(10):1-12.

[13] Woodrick RS,Ruderman EM. IL-6 inhibition for the treatment of rheumatoid arthritis and other conditions[J]. Bull NYU Hosp J Dis,2012,70(3):195-9.

[14] Aref-Eshghi E,Liu M,Harper PE,et al. Overexpression of MMP13 in human osteoarthriticcartilage is a ssociated with the SMAD-indeendent TGF-β signaling pathway[J]. Arthritis Res Ther,2015,17(264):1-8.