丹皮酚干预联合靶向沉默肾上腺髓质素对胃癌细胞生物学行为的影响

孙晶，李岩，乔富浩

(新泰市中医医院，山东泰安271200)

丹皮酚是从毛茛科植物牡丹干燥根皮中提取的一种植物活性成分，属于苯酚类物质，具有解热、镇痛、抗炎等多种药理作用[1]。近年研究发现，丹皮酚还具有抗肿瘤作用，能抑制结直肠癌、胃癌、食管癌等多种肿瘤生长[2，3]。肾上腺髓质素(AM)最初是从人嗜铬细胞瘤组织中分离出来的一种具有扩血管和利尿活性的多肽，后来研究证实，其在多种肿瘤组织中过表达，并对肿瘤的发生、发展具有一定调控作用。有研究发现，通过小干扰RNA(siRNA)技术靶向沉默AM能抑制肿瘤细胞增殖和凋亡[4]。但丹皮酚联合AM沉默能否增强抗肿瘤效果目前尚不清楚。2017年1月～2018年4月，我们观察了丹皮酚联合AM沉默对胃癌细胞生物学行为的影响。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 胃癌细胞BGC-823(以下称BGC-823细胞)，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，液氮中低温保存。丹皮酚注射液，规格5 mg/mL，宁波天真制药有限公司。超净工作台，上海精密仪器仪表有限公司；Multiskan FC酶标仪、Attune NxT流式细胞仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Transwell小室，美国Corning公司；AlphaImager2200凝胶成像分析系统，美国Alpha公司；Western blotting SDS-PAGE胶，成都艾特姆生物科技有限公司；PVDF膜，美国Millipore公司。MTT，美国Sigma公司；AnnexinV-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，上海炎彬化工科技有限公司；GIMSA染色液，华中海威(北京)基因科技有限公司。

1.2 细胞传代培养 将液氮中冻存的BGC-823细胞取出后尽快复苏，接种于含10% FBS的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。每2天更换1次培养基。当细胞融合80%以上时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代。取传3代对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 靶向沉默AM的siRNA筛选 由吉玛基因公司根据文献[4]设计了3条靶向沉默AM的siRNA。siRNA-839：正义序列5′-GCCCAUGGUACAAGGAAUATT-3′，反义序列5′-UAUUCCUUGUACCAUGGGCTT-3′；siRNA-1008：正义序列5′-GCUUCGCUUCCUUAGCCUUTT-3′，反义序列5′-AAGGCUAAGGAAGCGAAGCTT-3′；siRNA-1135：正义序列5′-GCUCGCCCACAAACUG-AUUTT-3′，反义序列5′-AAUCAGUUUGUGGGCGAGC-TT-3′。采用Real-time PCR法和Western bloting法验证3条siRNA靶向沉默AM的效率。经验证，160 μmol/L siRNA-839靶向沉默AM的效率最高，故选择siRNA-839进行后续实验。

1.4 丹皮酚联合siRNA-839药物相互作用及丹皮酚最佳浓度和作用时间筛选 取传3代、对数生长期BGC-823细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM培养液重悬，制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。取细胞悬液接种于96孔板，每孔100 μL。随机将细胞分为0 mg/mL 丹皮酚组、7.81 mg/mL 丹皮酚组、15.63 mg/mL 丹皮酚组、31.25 mg/mL丹皮酚组、62.50 mg/mL丹皮酚组、125.00 mg/mL 丹皮酚组，每组设6个复孔；然后分别加入160 μmol/LsiRNA-839、7.81 mg/mL 丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、15.63 mg/mL 丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、31.25 mg/mL丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、62.50 mg/mL丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839、125.00 mg/mL 丹皮酚+160 μmol/L siRNA-839，并置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。各组分别于培养24、48、72 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL孵育4 h，再加入DMSO 200 μL，充分振荡，使结晶充分溶解。酶标仪570 nm波长处检测各孔的吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验孔A570值/对照孔A570值)×100%[5]。实验重复3次，取平均值。结果见表1。采用两药相互作用指数(CDI)[6]评价不同浓度丹皮酚联合siRNA-839对BGC-823细胞的药物相互作用性质。结果显示，不同浓度丹皮酚联合siRNA-839对BGC-823细胞增殖抑制率均表现为协同作用，以62.50 mg/mL丹皮酚联合160 μmol/L siRNA-839作用48 h时协同作用最明显(CDI=0.507)。故选择62.50 mg/mL 丹皮酚联合160 μmol/L siRNA-839作用48 h时进行后续实验。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

注：与0 mg/mL丹皮酚组培养同时间比较，*P<0.05；与7.81 mg/mL丹皮酚组培养同时间比较，#P<0.05；与15.63 mg/mL丹皮酚组培养同时间比较，△P<0.05；与31.25 mg/mL丹皮酚组培养同时间比较，▲P<0.05；与同组培养24 h比较，▽P<0.05。

1.5 丹皮酚干预联合靶向沉默AM对BGC-823细胞生物学行为影响的观察

1.5.1 细胞增殖能力 采用平板克隆增殖实验。取传3代、对数生长期BGC-823细胞100个，接种于6孔板(内含10% FBS的DMEM培养基)。随机将细胞分为空白对照组、丹皮酚组、siRNA-839组、联合组，每组设3个复孔。空白对照组加入含10% FBS的DMED培养基1 800 μL和生理盐水200 μL，丹皮酚组加入含10% FBS的DMED培养基1 875 μL和丹皮酚注射液125 μL，siRNA-839组加入含10% FBS的DMED培养基1 840 μL和160 μmol/L siRNA-839 160 μL，联合组加入含10% FBS的DMED培养基1 715μL、丹皮酚注射液125 μL和160 μmol/L siRNA-839 160 μL。均置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，至肉眼可见的细胞增殖克隆时终止培养。PBS清洗，加入甲醇5 mL固定15 min，弃固定液，加入GIMSA染色液染色10～20 min。流水冲洗后，置于超净台空气干燥，于10倍显微镜下计数大于10个细胞的克隆数，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。实验重复3次，取平均值。

1.5.2 细胞侵袭能力 采用Transwell侵袭实验。取BD matrigel基质胶4 ℃冰箱过夜，次日，将BD Matrigel基质胶用不含血清的DMEM按1∶9比例稀释，取50 μL均匀涂于Transwell小室上层，再加入100 μL不含血清的DMEM培养液，水化BD Matrigel基质胶30 min；Transwell小室下层中加入含10% FBS的DMEM培养液500 μL。取传3代、对数生长期BGC-823细胞，用DMEM培养液重悬，制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。按1.5.1中方法分组处理48 h，取1.0×105个细胞加入Transwell小室上室，然后将Transwell小室置于预冷的24孔板，37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养24 h。取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去小室上层细胞，4%多聚甲醛固定10～15 min，0.1%结晶紫染色，显微镜下观察。随机选取10个视野，Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照，计数穿膜细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.5.3 细胞迁移能力 采用细胞划痕实验。取传3代、对数生长期BGC-823细胞，用DMEM培养液重悬，制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。取细胞悬液接种于6孔板(内含10% FBS的DMEM培养基)，每孔2.5×105个细胞，按1.5.1中方法分组处理48 h，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。当细胞融合达90%时，用10 μL移液器枪头垂直过中心划直线，吸弃旧培养基，用无血清的DMEM培养液清洗，去除划下的细胞，重新加入无血清的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。培养48 h，取出6孔板，拍照，测量细胞划痕处间距。实验重复3次，取平均值。

1.5.4 细胞凋亡率 采用流式细胞术。取传3代、对数生长期BGC-823细胞，用DMEM培养液重悬，制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。取细胞悬液接种于6孔板(内含10% FBS的DMEM培养基)，每孔2.5×105个细胞。按1.5.1中方法分组处理48 h，置37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。培养24 h，收集细胞并置于EP管中，室温下加入1×Binding Buffer 100 μL重悬，然后加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL，轻轻混匀，室温避光反应10 min，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

各组细胞增殖、侵袭、迁移能力和凋亡率比较见表1。

表1 各组细胞增殖、侵袭、迁移能力和凋亡率比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与丹皮酚组比较，#P<0.05；与siRNA-839组比较，△P<0.05。

3 讨论

丹皮酚是从毛茛科植物牡丹皮中提取物出来的一种单体成分，具有解热、镇痛、抗炎等多种药理作用[7]。近年研究还发现，丹皮酚在体外对人红细胞白血病细胞K562、人乳腺癌基因细胞株T6-17、肝癌细BEL-7404等肿瘤细胞增殖具有抑制作用，具有抗肿瘤作用[8]。目前认为，丹皮酚的抗肿瘤作用机制可能与提高TNF-α、IL-2生成和降低Bcl-2/Bax有关[9，10]。AM是从嗜铬细胞瘤组织分离的、含有52个氨基酸的多肽类物质，具有舒张血管、降低血压，扩张支气管平滑肌，促进胃酸分泌等生物学作用。近年研究发现，AM还是肿瘤细胞的生长因子，在促进肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成等文献具有重要作用；肿瘤细胞内低氧环境可诱导AM表达升高，激活VEGF和HIF-1等相关信号通路,继而促进肿瘤生长[11～14]；还可通过调节多种肿瘤细胞内cAMP和Ca2+浓度来刺激原癌基因表达，肿瘤细胞自体合成AM受体及其配体，以AM受体/配体自分泌的形式调节肿瘤生长[15，16]。采用siRNA技术靶向沉默AM可抑制调控肿瘤细胞生长的相关通路被激活，从而制肿瘤生长。本研究设计的siRNA-839即是针对肿瘤细胞中AM的靶向沉默基因，其可从分子信号通路上精准地降低AM表达，继而抑制AM对肿瘤生长的刺激作用，延缓甚至阻断肿瘤进展。

本研究结果显示，联合应用丹皮酚和siRNA-839对BGC-823细胞增殖的抑制具有协同作用，且62.50 mg/mL丹皮酚联合160 μmol/L siRNA-839作用48 h时的协同作用效果最明显。本研究进一步观察了二者联用对BGC-823细胞生物学行为的影响，结果发现，联合组克隆形成率、穿膜细胞数均明显低于丹皮酚组和siRNA-839组，划痕间距、细胞凋亡率均明显高于丹皮酚组和siRNA-839组，且丹皮酚组与siRNA-839组比较差异均无统计学意义。说明丹皮酚与siRNA-AM在合适剂量下联用具有明显的协同抗肿瘤作用。

综上所述，丹皮酚与siRNA-839联用可协同抑制胃癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力并促进其凋亡；丹皮酚的最佳浓度为62.50 mg/mL，siRNA-839的最佳浓度为160 μmol/L。本研究为丹皮酚与基因靶向药物联合应用治疗胃癌提供了重要依据。

参考文献：

[1] 耿帅，赵育林，曾凯，等.丹皮酚的研究进展[J].中国新药与临床杂志，2016，35(5)：310-313.

[2] 高立民，满其倩.丹皮酚抗肿瘤作用及作用机制研究进展[J].药物评价研究，2016，39(2)：296-299.

[3] 李倩男，王琳琳，汤剑明，等.丹皮酚通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制人卵巢癌A2780细胞增殖的实验研究[J].中华实用诊断与治疗杂志，2017，31(11)：1062-1066.

[4] 李曼红,曾庆纯.肾上腺髓质素与微血管密度在子宫颈癌中的表达意义研究[J].中国实用医药，2015，10(12)：58-59.

[5] 李秉枢，付琼，程艳香，等.丹皮酚协同顺铂抗人宫颈鳞癌SiHa细胞及其机制[J].肿瘤学杂志，2010，16(11)：845-848.

[6] 张萌，边志刚，何平.葫芦素B对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响[J].实用药物与临床，2016，19(5)：548-552.

[7] 戴凌，田小林，谭宁，等.EMMPRIN基因增强CT26小鼠结肠癌细胞的转移潜能[J].中国癌症杂志，2010，20(9)：652-657.

[8] Xu Y,Zhu JY,Lei ZM,et al. Anti-proliferative effects of paeonol on human prostate cancer cell lines DU145 and PC-3[J]. J Physiol Biochem,2017,73(2):157-165.

[9] 刘同亭.徐长卿抗肿瘤分子生物学机制的研究进展[J].实用医药杂志，2016，33(5)：455-458.

[10] 相萍萍，许楠，陆澄.丹皮酚对甲状腺未分化癌FRO细胞相关lncRNA表达的影响[J].中医药学报，2015，43(5)：27-30.

[11] Cai J,Chen S,Zhang W,et al. Paeonol reverses paclitaxel resistance in human breast cancer cells by regulating the expression of transgelin 2[J]. Phytomedicine,2014,21(7):984-991.

[12] 曾凡清，张蕾，马明艾，等.丹皮酚对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响及其可能的机制[J].中国生物制品学杂志，2013，26(10)：1454-1457.

[13] 李岩，王平，丁晓彦，等.不同产地丹参脂溶性成分对H9C2心肌细胞缺氧缺糖损伤保护作用的差异[J].山东科学，2015，28(2)：18-25.

[14] 屈振，徐明，卢明柱，等.肾上腺髓质素在肝癌组织中的表达及其与肿瘤组织微血管密度的关系[J].胃肠病学和肝病学杂志，2014，23(5)：489-490.

[15] 乔娜，王东彬，李中华，等.肾上腺髓质素和其受体在肾细胞癌组织中的表达和意义[J].山东医药，2012，52(15)：72-73.

[16] 李云涛，崔娜，陈丽芬，等.乳腺癌中肾上腺髓质素的表达及其与癌组织分化、转移间的关系[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2009，16(1)：80-83.