阿尔茨海默病患者淀粉样斑块的对比增强磁共振成像与淀粉样变的血清标志物的相关性研究

张宇哲 曹秋云 杨海龙 赵 鹏 沈迪文

阿尔茨海默病患者(Alzheimer’s Disease，AD)属于发病率较高的神经系统退行性疾病之一，是导致老年痴呆性疾病发生的主要因素[1]。据国际阿尔茨海默病协会(ADI)发布的数据，目前全球已经超过3 500万人罹患该疾病，截至2050年预计AD可能增加至1.15亿人次[2]。虽然目前针对AD的发病机制的研究众多，然而其发病机制仍未完全明确，加之目前针对该疾病尚未制定出有效的防治措施，故而该疾病成为威胁人类健康的“第三大杀手”，仅次于恶性肿瘤和心脑血管类疾病[3]。目前的研究证实，AD的特征性病理改变是患者大脑皮层和海马内的β淀粉样蛋白沉积，导致老年斑的形成和tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结，从而导致脑皮层和海马区神经元细胞的减少[4，5]。也有学者认为，该疾病是由血管系统紊乱引起脑循环低灌注导致的认知功能受损所导致的[6～8]。核磁共振成像的主要优势在于其多参数、多方位成像，且组织对比分辨率高，对细小结构的萎缩方面也能清晰显示，故而在AD的临床诊断中广泛应用MRI影像学检查并取得了较高的诊断效果[9]。临床研究证实，海马是AD患者的主要病理学改变处，要想通过影像学手段检测AD大脑特征性的病理改变，即淀粉样斑块，需要从淀粉样斑块的核心成分Aβ的神经化学特征入手[10]。目前的研究证实，除了Aβ还有其他许多成分沉积，例如铁，能够导致斑块相关的神经毒性。MicroRNAs(miRNAs)属于非编码单链小分子RNA，共包含19～24个核苷酸[11]，其在细胞的生长、发育、分化以及凋亡过程中扮演重要角色[12]。miRNAs在神经元发生、学习、记忆及神经系统退行性疾病中扮演着重要的角色，直接或间接参与许多与AD发病相关基因的表达调控[13]。目前有研究证实，miRNAs可通过调节β淀粉样蛋白代谢、Tau磷酸化等AD病理发生过程中相关基因的表达[14]。本研究拟以AD患者和健康对照老年人为研究对象，分别对其大脑进行核磁共振成像和血清标志物研究，探讨两者的相关性，以期在AD患者疾病初期进行有效诊断，提高AD早期诊断率及治疗效果。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2011年9月～2015年7月间南京大学医学院附属鼓楼医院收治的108例年龄大于65岁的AD患者为研究组。选取105位年龄大于65岁的健康老年人为对照组。研究组男55例，女53例；平均年龄(71.74±5.51)岁；平均体质量(73.38±6.39)kg。对照组男53例，女52例；平均年龄(72.43±5.25)岁；平均体质量(71.54±6.51)kg。两组患者的性别构成比、年龄、体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 磁共振成像(MRI)检查[15]应用磁共振成像扫描仪(SIEMENS公司，型号：3.0T MAGNETOM Trio)对两组受试者实施的头颅成像扫描，头颅8通道相控阵列正交线圈。两组受试者全部进行横轴位T1WI、T2WI、FLAIR、DWI。然后以3.5 ml/s的速度予静脉团注0.2 mmol/kg对比剂钆喷替酸普甲胺(Gd-DTPA)，注射完成后立即以相同流速注等体积生理盐水冲管。然后先后行DSC灌注成像扫描，T1WI横轴位、冠状位和矢状位增强扫描。扫描参数主要包括：T1WI：TR 为250 ms，TE 为2.5 ms；T2WI：TR为 6 000 ms，TE为93 ms；扫描层厚度、层间距分别为5 mm、1.25 mm，矩阵为128×128，FOV 为230 mm×230 mm。DWI应用平面回波成像序列，TR 为7 000 ms，TE为80 ms，b值分别取 0 s/mm2以及1 000 s/mm2；DSC-PWI应用单次激发梯度回波-平面回波成像序列，TR为1 400 ms、TE为 32 ms，FOV 为230 mm×230 mm，矩阵为128×128，层数为18层， 层厚、层间隔分别为5 mm、1.25 mm。将采集的原始数据导入Siemens后处理工作站，通过头部核磁系统软件的计算，自动得出每一层的淀粉样斑块，然后乘以扫描层厚，得到各层的淀粉样斑块体积，进而相加得到淀粉样斑块总体积[16]。

1.2.2 血清标志物的检测[17]

1.2.2.1 血清miRNA的提取 (1)血清样本采集：收集研究组和对照组受试者血液样本，在室温下采用离心机10 000 r/min离心5 min，收集血清置于-70℃冰箱保存备用。(2)血清miRNA的提取：将收集的患者血清，按照体积比2∶1加入Trizol溶剂，充分震荡，于室温条件下静置15 min。加入氯仿(体积为20%)，充分震荡，于室温条件下静置15 min。采用离心机10 000 r/min离心15 min(4℃)，收集上清。加入等体积水饱和酚，震荡后采用离心机10 000 r/min离心15 min(4℃)。收集上清，加入50%体积的水饱和酚，震荡均匀后采用离心机10 000 r/min离心15 min(4℃)。收集上清，加入等体积异丙醇，震荡均匀后冰上沉淀1 h，采用离心机10 000 r/min离心30 min(4℃)。弃上清后，采用3 mL 75%乙醇和3 mL Trizol先后逐个清洗沉淀。当沉淀干燥后，加入LDEPC水50 u以溶解RNA，对样本总RNA浓度进行测定。

1.2.2.2 Hiseq测序 采用Illumina HiSeqTM 2000高通量测序技术对AD患者以及正常对照组受试者血清中全部miRNAs的表达谱进行定量分析。

1.2.2.3 血清miRNA提取(实时定量PCR) 采用Trizol and miRNeasy mini kit试剂盒进行血清中总RNA的提取。RNA的纯度采用260 nm和280 nm处吸光度值的比值(A260/A280)表征，1.8～2.1为质量合格。

1.2.2.4 实时定量PCR(qRT-PCR) 根据文献，miRNA不具有PolyA结构，因此加尾反应应于反转录反应前进行，采用Universal Adaptor Primer进行反转录反应获得cDNA，随后进行定量反应。

1.2.3 统计学方法 本研究中应用McDonald法对qRT-PCR结果进行标准化，内参为miR-cel-39，相对表达量采用2-ΔΔCt进行表征。应用SPSS 19.0软件进行统计分析，计数资料以例数和百分率(%)表示，采用趋势χ2检验推断AD患者淀粉样斑块的对比增强磁共振成像与淀粉样变的血清标志物的相关性和相关系数，采用Pearson相关系数对变量之间的相关性进行评估，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 磁共振成像测定结果 对两组患者的脑组织中淀粉样斑块体积进行测定，对照组脑组织中未见淀粉样斑块，而AD患者组的颅脑总淀粉样斑块体积为1 363.76 mm3。

2.2 Hiseq测序结果

2.2.1 初筛结果 根据筛选标准，AD患者血清miRNAs拷贝数大于10且变化2倍以上认为有意义。得到14种miRNA进行复筛。见表1。

表1 初筛的14种miRNA

2.2.2 复筛结果 应用qRT-PCR法复筛已经初筛出的14种miRNA。miR-485-5p及miR-151b在未超过75%的样本中均未检测到。另外，novel-mir-36、miR-3158-3p、miR-30e-5p、miR-27a-3p、miR-26b-3p和let-7g-5p六个miRNAs在研究组和对照组血清中表达差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p六个miRNAs在研究组和对照组血清中表达差异有统计学意义(P<0.05)。并且上述六个miRNA在研究组血清中的表达量低于对照组血清(P<0.05)。见表3。

表2 复筛结果(1)

表3 复筛结果(2)

2.3 磁共振成像结果与血清中miRNAs表达量的相关性分析 将两组的颅脑总淀粉样斑块体积和血清中miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p表达量进行相关性分析，结果显示，颅脑总淀粉样斑块体积与血清中miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p表达量呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 磁共振成像结果与血清中miRNAs表达量的相关性分析(r)

注：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

AD的特征性病理改变是患者大脑皮层和海马内的β淀粉样蛋白沉积，导致老年斑的形成和tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结，从而导致脑皮层和海马区神经元细胞的减少[18]。核磁共振成像的主要优势在于其多参数、多方位成像，且组织对比分辨率高，对细小结构的萎缩方面也能清晰显示，故而在AD的临床诊断中广泛应用MRI影像学检查并取得了较高的诊断效果[19]。临床研究证实，海马是AD患者的主要病理学改变处，可通过影像学手段检测AD大脑特征性的病理改变，即淀粉样斑块。对比增强磁共振成像测定结果显示对照组脑组织中未见淀粉样斑块，而研究组的颅脑总淀粉样斑块体积为1 363.76 mm3。AD的临床研究是比较复杂的，本研究采用MRI的脑功能成像和对比剂增强很好地测定了患者颅脑内淀粉样斑块体积，对于明确诊断AD具有重要的意义，为脑类疾病的研究提供更多可靠的信息。

目前有研究证实，AD患者的脑组织中异常表达的miRNAs可调节β淀粉样蛋白代谢、Tau磷酸化等AD病理发生过程中相关基因的表达，在AD疾病的进展过程中发挥了重要作用[20]。目前已经找到了脑脊液中特异性的miRNA作为潜在的疾病诊断的生物标志物。但是脑脊液的获得具有一定的风险，因此从血液中找到有效的标志物便具有更重大的意义。本研究以AD患者和健康对照老年人为研究对象，分别对其血清标志物研究，首先在小批量样本即初筛组中得到14种miRNA，然后运用qRT-PCR对初筛出的14种miRNA进行复筛。本研究发现，novel-mir-36、miR-3158-3p、miR-30e-5p、miR-27a-3p、miR-26b-3p和let-7g-5p六个miRNAs在研究组和对照组血清中表达差异无统计学意义(P>0.05)。但是，miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p六个miRNAs在AD患者血清中的表达量低于对照组血清(P<0.05)，推测此六种miRNAs或许可以作为AD诊断的生物标志物。有学者研究了AD患者血清外吐小体中miRNA的表达情况，发现了14个miRNA表达水平上调[21]。其结果与本研究不完全相符，这可能是因为一方面两项研究样本量不够多，样本间差异导致的，另一方面则可能是因为部分miRNA不稳定导致的。

为进一步探究上述六个miRNAs作为AD诊断的生物标志物的可能性，本研究还探究了AD患者淀粉样斑块的对比增强磁共振成像与血清标志物的相关性发现：AD患者淀粉样斑块的对比增强磁共振成像与血清标志物miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p表达量呈正相关。说明上述六个miRNA表达量在AD患者体内异常表达可能与AD患者颅脑内的淀粉样斑块的形成相关。可进一步探究该miRNA调控AD患者发病过程的机制，为其作为AD生物标志物的可能性提供依据。

综上所述，血清中miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和let-7d-5p能够作为潜在的AD生物标志物[22]。本研究中血清miRNA与AD患者淀粉样斑块的对比增强磁共振成像相关性分析具有重大的临床意义，为AD患者的早期预警、诊断和治疗提供帮助。