miR- 207在大鼠纤维化肾组织及尿液中表达上调

石变华，孙佳增，张 尚，史 娟

(中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究所 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

肾脏纤维化(renal fibrosis, RF)是慢性肾脏疾病终末期的主要病理改变，表现为正常肾单位被成纤维细胞及肌成纤维细胞代替，细胞外基质(extracellular matrix, ECM)堆积等[1]。转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)在肾脏纤维化发生中有关键作用[2]。microRNA(miRNA)是进化保守的非编码小分子RNA，可由细胞和组织释放入循环系统[3]，可作为多种疾病和组织损伤生物标志物。目前通过活体组织诊断肾脏纤维化，因此寻找简便、准确的生物标志物对诊断与监测肾间质纤维化至关重要。

在前期研究中构建了大鼠肾脏纤维化模型，利用第2代高通量测序方法，筛选尿液中差异表达的转录本[4]，发现lncRNA NONRATT042796表达上调，而且是rno-miR- 207的前体序列。本研究分析了rno-miR- 207的表达及功能，为肾脏纤维化诊断提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠，8 周龄，体质量190～230 g[北京维通利华实验动物技术有限公司 SCXK(京)2015- 0001]。

1.1.2 主要试剂：胎牛血清(10270)、胰蛋白酶和DMEM培养液(Gibco公司)；Trizol、LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen公司)；M-MMV反转录酶、RNA酶抑制剂以、转录缓冲液和RNase-free 水(Promega公司)；dNTP Mix和real-time PCR mix(TaKaRa公司)；TGF-β(Peprotech公司)；miR- 207模拟物mimics及其阴性对照、miR- 207抑制剂及其阴性对照(上海吉玛制药技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备：腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉。实验组大鼠(unilateral ureteral obstruction, UUO)于近肾门处结扎右侧输尿管，再于输尿管远离肾门处做2次结扎。假手术组只分离右侧输尿管，不结扎。腹腔注射等量青霉素后关闭腹腔。

1.2.2 细胞转染：将miR- 207模拟物mimics及其阴性对照，miR- 207抑制剂及其阴性对照的冻干粉分别用无RNase水溶解。将铺于6孔板中的细胞换成新鲜完全培养基，取246 μL无血清RPMI1640培养基加入4 μL脂质体LipofectamineTM2000，吹打混匀后静置5 min。另取250 μL无血清RPMI 1640培养基加20 nmol/L RNA片段。混匀后，静置20 min。将转染液加入增殖于6孔板的细胞中，置细胞培养箱中，细胞转染36 h后加入LPS(1 mg/L)，继续培养12 h。

1.2.3 RNA抽提及质检：收集肾脏组织或尿液，采用Trizol法提取总RNA，使用Nanodrop测定RNA的吸光度值，以计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

1.2.4 实时定量PCR检测RNA表达：采用Trizol法提取细胞总RNA(按说明书操作)，紫外分光计测定RNA浓度，计算纯度，取A260/A280比值为1.8～2.0的RNA样品进行反转录。cDNA第一条链的合成按照说明书进行。以新合成的cDNA为模板。建立PCR反应体系。PCR程序如下：95 ℃ 5 min，40个PCR循环(95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s)。数据采用2-ΔΔCt法进行分析。引物序列见表1。肾脏组织及细胞的RT-qPCR 结果由GAPDH 作为内参，尿液样本中的RT-qPCR 结果由cel-miR- 39 作为内参。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR- 207在肾纤维化大鼠肾脏和尿液中表达均上调

肾纤维化大鼠的肾脏和尿液中miR- 207的表达均上调 (图1)。

*P<0.05 compared with control图1 实时定量PCR检测miR- 207表达Fig 1 Analysis of miR- 207 expression by real-time

2.2 TGF-β 通路对miR- 207的表达调控

TGF-β显著上调了miR- 207在大鼠肾小管上皮NRK- 52E 细胞中的表达，并呈现出时间依赖性和剂量依赖性(作用时间为12 h) (图2)。

图2 在大鼠肾小管上皮NRK52E细胞中，TGF-β诱导miR- 207的表达Fig 2 TGF-β induced miR- 207 expression in NRK52E cells

2.3 对纤维化相关基因表达的影响

分别将miR- 207模拟物mimics、抑制剂inhibitor转染大鼠肾小管上皮NRK- 52E细胞，二者可有效影响细胞中miR- 207的表达水平(图3)。细胞中转染miR- 207 mimics后TGF-β诱导的Col1a1, Col3a1, Ctgf和Fn1的基因表达增加，而敲低miR- 207后TGF-β诱导的Col1a1, Col3a1, Ctgf和Fn1的基因表达被抑制(图4)。

图3 miR- 207 mimics和inhibitor对大鼠肾小管上皮NRK52E细胞中miR- 207的影响Fig 3 miR- 207 mimics and inhibitor affected the expression of miR- 207 in NRK52E cells

图4 miR- 207对肾纤维化相关基因表达的影响Fig 4 miR- 207 affected the expression of gene related to renal fibrosis

3 讨论

肾脏纤维化程度与慢性肾脏疾病的治疗及预后密切相关。目前判定肾脏组织纤维化的金标准是活体组织检查。寻找方便、精确的生物标志物，对诊断与监测肾间质纤维化至关重要[5]。miRNA是一类具有介导基因转录后表达调控功能的非编码小分子RNA，lncRNA是碱基数大于200个核苷酸的非翻译转录本，通过基因印迹、染色质重塑、剪接调控等多种机制发挥功能。

在前期研究中构建了大鼠肾脏纤维化模型，利用第2代高通量测序的方法，筛选肾脏纤维化发生发展过程中尿液中差异表达的转录本，发现lncRNA NONRATT042796表达上调，是rno-miR- 207的前体序列。利用Targetscan数据库预测miR- 207的靶分子，发现其与TGIF2 3′UTR区存在相互结合位点。TGIF2可作为共转录因子抑制TGF-β信号通路,后者与纤维化疾病的发生发展密切相关，能诱导细胞内Smad蛋白活化[6- 9]。此外，研究发现TGIF2可抑制角膜基质细胞的纤维化表型[10]。上述研究提示miR- 207可能与肾脏纤维化相关。本实验通过研究rno-miR- 207的表达及功能，为肾脏纤维化的诊断提供潜在生物标志物。

首先利用RT-qPCR方法检测肾纤维化大鼠肾脏和尿液中miR- 207的表达水平，发现miR- 207的表达水平均上调。还发现TGF-β能显著上调miR- 207在大鼠肾小管上皮NRK- 52E 细胞中的表达，并有时间和剂量依赖性。说明TGF-β通路可能参与了对miR- 207的表达调控。

肾脏纤维化表现为正常肾单位丢失，成纤维细胞增生，功能缺失以及胶原蛋白和纤连蛋白等细胞外基质堆积等。TGF-β在纤维化过程中能够诱导纤维化相关蛋白Col1a1, Col3a1, Ctgf和Fn1的表达[8,11]。向NRK- 52细胞中转染miR- 207 mimics或inhibitor观察miR- 207对纤维化相关基因的影响。发现转染miR- 207 mimics后TGF-β诱导的Col1a1,Col3a1,Ctgf和Fn1的基因表达增加，而敲低miR- 207后TGF-β诱导的基因表达被抑制。说明miR- 207在TGF-β调控的纤维化过程中有重要的作用。

以上结果表明miR- 207在肾脏纤维化发生过程中的功能可能由TGF-β/Smad 信号调控，并对纤维化相关基因的表达进行调控，可能形成一个肾脏纤维化调节反馈回路，为肾脏纤维化诊断提供新的方法。

参考文献：

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