草鱼呼肠孤病毒NS79蛋白多克隆抗体制备

（河南师范大学水产学院，河南新乡 453007）

草鱼（Grass carp,Ctenopharyngodon idellus)是我国的四大家鱼之一，作为一种草食性鱼类，草鱼价格便宜，养殖饲料便于购买，对养殖地域的要求不严格，是我国淡水养殖产量最高的鱼类之一，具有很高的经济价值。虽然草鱼的经济价值很高，但是其病害也多，其中草鱼病毒性出血病为公认的危害草鱼养殖最严重的疾病，它给水产业带来了巨大的损失[1]。

草鱼出血病传染率高，致病性强，流行范围广，在广西、广东、江苏、湖南和湖北等地区都有流行，死亡率高达80%[2]。青鱼、稀有鮈鲫和麦穗鱼等水生动物也能被此病毒感染[3,4]，因此草鱼呼肠孤病毒引起的草鱼出血病的防治工作非常困难。1972年首次报道此病，1978年确定为病毒病[5]，1980年首次在病鱼的肾组织及头肾组织超薄切片中观察到呈晶格状排列的病毒颗粒[6]，1983年，陈燕燊等将病毒分离，从病鱼组织里获取到的滤液，去感染草鱼，得到典型的出血症状，病毒在细胞中能够进行传代繁殖，对病毒的形态结构和理化特性的研究，测得该病毒核酸为双股RNA[7]。故将其定名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)。草鱼呼肠孤病毒属于呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属。该病毒严重影响一些亚洲国家（如中国、朝鲜、越南）的淡水养殖业发展，重点体现在主要品种草鱼在鱼种阶段经常发生草鱼出血病。此病毒流行范围广、危害程度大、死亡率高、发病季节长，严重危害各地渔业的正常发展[8,9]。病毒形状为二十面体的球型颗粒，其直径为70-80 nm，具有双层衣壳，无囊膜结构。主要成分为蛋白质和核酸，还含有少量的糖类，以糖蛋白的形式存在，不含脂类[9]。病毒基因组为双链RNA，基因组由11个基因节段组成，表示为S1-S11[10]。

本实验选取的NS79蛋白是由草鱼呼肠孤病毒GCRV-HN14株S4节段编码的蛋白[11]。就目前而言，尚没有相关文献报道NS79蛋白在病毒感染中的作用，因而其实际功能仍不清楚。而Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒作为目前国内分布最广、流行最为严重、致病力最强的草鱼呼肠孤病毒，NS79蛋白很可能与其所特有的一些生物学特性密切相关。本实验通过对草鱼呼肠孤病毒NS79基因原核表达质粒的构建及多克隆抗体的构建，以用于后期对该基因的功能及其致病相关性的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

毒株和载体：毒株GCRV-HN14来自本实验室分离，大肠杆菌E.coliDH5α和BL21(DE3)、原核表达载体 pET-32a（+）。

主要试剂：琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、Taq酶、DL2000 DNA marker、蛋白 marker。

1.2 实验方法

1.2.1 从被感染GCRV-HN14病毒的鱼体内提取总RNA

取感染GCRV-HN14病毒的草鱼，取草鱼鳃组织0.2 g，加入1 ml PBS(磷酸缓冲盐溶液）进行充分研磨，取约 100 μl，加入 1 ml Trizol，按操作说明进行总RNA的提取，提取的总RNA，溶于20μl DEPC处理水中。

1.2.2 病毒RNA的逆转录

取总 RNA 4 μl，94℃，5 min 打开病毒 RNA 双链，然后加入特异性引物 NS79-32a F：5‘-GATGAATTCAAGGCTCTATGCTCAT’3 进行逆转录，42℃延伸1 h。

1.2.3 NS79基因PCR的扩增和鉴定

根据草鱼呼肠孤病毒NS79基因的cDNA序列，设计一对带特异性酶切位点的引物，扩增NS79 C端471 bp的序列，上游引物为NS79E-32aF，前端加入了EcoRI酶切位点，下游引物：TAAGCGGCCGCCTAATGGCCTGAGTCGTAGAAC，加入了NotI酶切位点。在PCR仪中进行PCR扩增目的基因片段。反应体系：PCR 反应总体积为 25 μl，Buffer 2.5 μl，dNTP 1 μl，正向引物 0.5 μl，反向引物 0.5 μl，Taq 酶 0.5 μl，DNA 模板 1 μl，水 19 μl。 反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性时间 35 s，53℃退火时间 30 s，72℃延伸时间1 min，35个循环后，于72℃延伸时间10 min，琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 重组质粒NS79E-pET-32a的构建及鉴定

在凝胶成像仪中切下含有目的基因的DNA条带，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。以EcoRI和NotI对目的基因及原核质粒载体pET-32a进行双酶切,酶切后的目的基因片段和载体片段进行DNA回收，T4 DNA连接酶将目的基因NS79和pET-32a载体连接成重组质粒，连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌细胞，涂布在含有Amp的LB平板上，挑取培养基上的单个菌落，接种到含Amp的LB液体培养基，于37℃温箱中过夜培养。PCR检测挑取的扩大培养的菌落，将阳性克隆菌落送测序，检测目的基因序列及连接的正确性。对测序正确的阳性菌扩大培养，质粒小量提试剂盒提取重组质粒NS79E-32a，双酶切验证。

1.2.5 目的基因的诱导表达和纯化

将重组质粒NS79E-32a转化到感受态BL21（DE3）大肠杆菌细胞中，与转化大肠杆菌DH5α相同，对挑取的菌落进行PCR检测，阳性菌接种100 ml含Amp的LB液体培养基进行扩大培养，培养至菌体OD600吸光度值为0.4-0.6时，添加IPTG至终浓度为1.0 mM诱导蛋白表达，37℃，6 h后，分别取诱导前后菌体沉淀进行SDS-PAGE分析。对大量诱导的菌体，离心收集菌体沉淀，用20 mL的结合缓冲液（2.4 g Tris，29.2 g NaCl，0.34 g 咪唑，溶解于蒸馏水至1000 mL，调pH7.9）重悬沉淀，超声破碎 1h，收集沉淀用含6 M尿素的结合缓冲液10 ml过夜冰上溶解，溶解上清加入到Ni-IDA-Sefinose(TM)Resin柱，柱体积为1 ml，吸附重组蛋白。待上清流完后用10倍柱体积的含6 M尿素的结合缓冲液洗脱未结合在柱上的蛋白。用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液（2.4 g Tris，29.2 g NaCl，360 g 尿素，溶解于蒸馏水至1000 mL，其中咪唑浓度分别为20 mM、40 mM、60 mM、100 mM和500 mM。）SDS-PAGE检测各洗脱液中重组蛋白的纯度，将含高浓度重组蛋白的洗脱液进行透析复性，将得到重组的蛋白进行SDS-PAGE检测。

1.2.6 NS79蛋白多克隆抗体的制备

将纯化的重组蛋白与佐剂按1∶1的进行混合，对重组蛋白进行乳化，经皮下六点注射对1只新西兰大白兔进行免疫，在第1、2、3及4周各免疫1次，每次免疫的抗原量约100 μg，于第4周耳缘静脉采血，分离血清。

1.2.7 血清抗体效价的检测

用ELISA法测定抗体效价。将纯化的重组蛋白作为抗原和包被液混合后包被到96孔板上，每孔5 μg，4℃过夜孵育，PBST（pH7.4）洗涤 3 次，加入牛血清白蛋白封闭，37℃，2 h，PBST（pH7.4）洗涤 3 次，加入2倍系列稀释的新西兰大白兔血清，37℃，1 h，PBST（pH7.4）洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG（1:5000 稀释）,37℃，1 h，PBST（pH7.4）洗涤3次，加入TMB底物溶液100 μL/孔，37℃ 孵育10 min，加入 2 mol/L 硫酸 50 μL/孔终止显色，在酶标仪450 nm处测定吸光值。

2 实验结果

2.1 PCR扩增产物的鉴定

以总RNA为模板，逆转录得到cDNA，采用特异性引物，PCR扩增后电泳检测，由图1可以看出，在约500 bp处的扩增条带，其大小与NS79基因大小基本一致，预测目的基因扩增成功。

2.2 重组表达质粒的构建

以EcoRⅠ和NotI对胶回收产物NS79基因和原核质粒载体pET-32 a进行双酶切，将酶切的NS79E片段和载体片段，通过T4DNA连接酶16℃过夜连接。转化DH5α大肠杆菌，PCR鉴定阳性菌并进行扩大培养，提取质粒，测序验证，结果显示扩增得到的基因片段以及质粒上的插入位点无误。转化到BL21(DE3)感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆，保存菌体。

2.3 重组质粒的表达和纯化

将含有重组质粒的菌株扩大培养，在紫外分光光度计下测其OD600为0.6时，用IPTG诱导，对诱导表达前后的菌体分别沉淀处理后，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测鉴定，并进行考马斯亮蓝染色1-2 h，进行脱色处理，取出显色清晰的凝胶进行观察，如图2所示，在分子量约为35 kDa处，诱导菌体对比未诱导菌体有一明显加粗的蛋白条带，即为诱导成功的NS79重组蛋白。将表达的重组蛋白用Ni-IDA柱纯化和透析除去尿素后，得到纯化的NS79重组蛋白，如图3所示。

图2 重组NS79诱导检测M：蛋白 marker；1：IPTG 诱导；2：IPTG 未诱导Fig 2.Induction of recombinant NS79M:protein marker;1,IPTG induction;2,No IPTG induction

图3 NS79重组蛋白纯化M：蛋白 marker；1-2：纯化的 NS79 重组蛋白Fig 3.Purification of recombinant protein NS79M:protein marker;1-2:purified NS79 recombinant protein

2.4 抗体的制备和抗体效价的检测

纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔，四周后耳缘静脉取血，静置后取上清，获得血清抗体，将纯化后的重组蛋白作为抗原包被到96孔板上，以2倍梯度稀释(起始稀释比1∶500)的抗体作为一抗，ELISA检测抗体效价，3次重复实验结果取平均值，若实验组与对照吸光值相比，比值大于等于2视为阳性，如图4所示，从图中看出测其抗体效价为1：64000时仍为阳性，因此抗体制备成功，可用于NS79功能的进一步研究。

图4 抗体效价检测图横坐标为抗体的稀释倍数，纵坐标为吸光值，每组数据三个重复，柱上线为误差线，误差线上数值为实验组的平均值与阴性对照平均值的比值Fig 4.Detection of antibody titer.The abscissa is the dilution of the antibody,the ordinate is the absorbance value,and each group has three replicates.The on-line is the error line.The numbers above error line is the ratio of the experimental group average with the negative control average.

3 讨论

草鱼出血病作为一种严重危害草鱼健康传染性疾病，流行范围广，致病性高，影响着我国淡水养殖业的正常发展，其病原体草鱼呼肠孤病毒是水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus，AQRV)中毒力最强的一种。虽然我国对草鱼呼肠孤病毒这一课题的研究比较早，但分子生物学、病原学、免疫学等层面的研究仍旧有待进一步的深入研究。本实验通过对草鱼呼肠孤病毒NS79基因原核表达质粒的构建，得到了正确的重组质粒，将重组质粒表达提取并且纯化蛋白，将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔，制备了NS79原核表达的多克隆抗体，用ELISA的方法检测的抗体的效价大于1:64000。就目前而言，尚没有相关文献报道NS79蛋白在病毒感染中的作用，因而其实际功能仍不清楚，但是我们可以根据其同源蛋白预测其功能。Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒中，非结构蛋白NS80蛋白形成病毒包涵体的基本结构，病毒包涵体是病毒组装和复制的场所[12]，并且招募病毒的其他蛋白到包涵体中，将病毒的各结构成分组装成完整的病毒粒子[13]。在Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒中，与NS80同源的蛋白为NS79蛋白，因而预测NS79蛋白也具有形成病毒包涵体的功能。Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒作为目前国内分布最广、流行最为严重、致病力最强的草鱼呼肠孤病毒，NS79蛋白很可能与其所特有的一些生物学特性密切相关，本实验对于II型呼肠孤病毒研究提供了前提基础，可用于NS79在病毒致病机制方面的研究。

[1]曾伟伟，王庆，王英英，等．草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]．水产学报，2013，37(3)：450-456．

[2]李安兴．草鱼病毒性出血病研究进展[J]．南方水产，2006，2(3)：66-71．

[3]Zhang L L，Luo Q，Fang Q，et al．An improved PTPCR assay for rapid and sensitive detection of grass carp reovirus[J]．J Virol Meth，2010，169：28-33．

[4]Mahy B W J，van Regenmortel Marc H V．Encyclo pedia of Virology[M]．3rd Academic Press，2008：163-169．

[5]中国科学院水生生物研究所病毒组，水生生物学集刊，6(1978)，321-330．

[6]中国科学院武汉病毒研究所，中国水产科学研究院长江水产研究所沙市分所草鱼出血病病毒研究协作组.草鱼出血病病毒的电子显微镜观察初报[J]．淡水渔业，1983(3):39-40．

[7]陈燕燊，江育林．草鱼出血病病毒形态结构及其理化特性的研究[J]．科学通报，1983，28:1138-1140．

[8]Zhang Q Y,Ruan H M，Li Z Q，et al．Detection of Grass Carp Hemorrhage Virus(GCHV)from Vietnam and Comparison with GCHV Strain from China[J]．High Technology Letters，2003，9(2)：7-13．

[9]陈延，王炜，柯丽华等.草鱼出血病病毒的糖蛋自和结构多肽的抗原性[J]．病毒学报，1992，3(1)：5761．

[10]张奇亚，桂建芳．水生病毒学[M]．北京：高等教育出版社，2008，85-91．

[11]Pei C，Ke F，Chen ZY，et al．Complete genome se quence and comparative analysis of grass carp re ovirus strain 109(GCReV-109)with other grass carp reovirus strains reveals no significant correla tion with regional distribution[J]．Arch Virol，2014，159：2435-2440．

[12]Trask S D,Mcdonald S M,Patton J T.Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication.[J].Nature Reviews Microbiology,2012,10(3):165.

[13]Ke F,He L B,Zhang Q Y.Nonstructural protein NS80 is crucial in recruiting viral components to form aquareoviral factories[J].Plos One,2013,8(5):e63737.