兔瘟抗体检测卡的研究及应用

唐世云 武玉香 庄金秋 郭广君 王玉茂

兔病毒性出血症又名兔瘟，是兔的一种急性、致死性的病症，具有高度接触性，以实质器官水肿、淤血和出血性变化为特征。针对本病危害严重，都用兔病毒性出血症组织灭活苗，对家兔进行免疫接种，但是，疫苗免疫后还有大量养殖场发生兔瘟，造成很大的经济损失。为此我们设想，有没有一种简便的检测兔瘟抗体的方法，一般实验室血凝检测方法在养殖户条件下操作性低，难以保证兔子兔瘟抗体的水平和防疫的有效性。笔者开展了兔瘟抗体试纸卡的研究，只需要几滴血就能测出抗体。根据检测情况，制定兔瘟的免疫时间、剂量等，制定兔瘟的免疫程序。

1试验材料

1.1材料与试剂

牛血清白蛋白（BSA），美国Sigma公司分装；氯金酸，Sigma；羊抗鼠lgG抗体，上海捷宁生物技术有限公司；硝酸纤维素膜，Sartorius公司；兔瘟单克隆抗体，山东绿都生物科技有限公司；PVC底板，上海金标生物科技公司；吸水纸，上海良信生物科技公司；

1.2仪器

QL-861涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；JE1002型电子天平（上海方瑞仪器有限公司）。UV1100紫外可见分光光度计（北京普析通用）；JK-ESS-500B恒温磁力加热搅拌器（上海麦尚科学仪器有限公司）；ZX1OOO bio-dot划膜平台（美国bio-dot公司），CT14RD高速冷冻离心机（德国BECK.MAN公司）；HGS201切条机。

2实验方法

2.1制备胶体金溶液

胶体金免疫层析技术是以胶体金作为标记物，其质量对检测体系起着至关重要的作用。最常用的制备胶体金的方法是化学还原法，不同种类的还原剂在相同搅拌速度下制备出的胶体金的粒径范围不同，通常情况下白磷法制备的胶体金粒径为5～12 nm，鞣酸为5.7 nm左右，抗坏血酸为8～13 nm，硼氢化钠仅为2 -5 nm，柠檬酸三钠为16～147nm。经过对比可以看到柠檬酸三钠制备的胶体金溶液，粒径范围比较广，其胶体金颗粒大小均匀，根据柠檬酸三钠加入的量不同可以制备出粒径不同的胶体金。在实验中，从最终制作出的检测卡显色条带的颜色效果、成本、稳定性以及产品的保质期方面考虑，一般认为粒径为20～40 nm的胶体金颗粒是最适合做快速测试使用，而胶体金粒径与质量与还原剂柠檬酸三钠的添加量、氯金酸与柠檬酸三钠反应的时间以及搅拌速度等多方面因素有关，然后再通过紫外可见扫描、透射电镜对金液中金颗粒进行验证评价，确定最佳的制备条件。本实验是采用柠檬酸三钠做还原剂制备胶体金，具体方法为量取99 mL的超纯水装入250 mL的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于恒温磁力加热搅拌器上，加入1 mL 1%氯金酸溶液，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液逐步变为灰色，后由灰色变红，最终变为酒红色，待颜色稳定后再继续加热10 min，待溶液冷却后，4℃保存备用。本实验采用柠檬酸三钠三种不同加入量（分别为1.5 mL、1 mL、0.5mL），制备三种不同粒径的胶体金溶液。通过电镜观察，当柠檬酸三钠的添加量为1ml，以200r/min速度搅拌时，其金颗粒大小均匀，外型为圆形，其直径大小为22nm左右，符合胶体金制备的要求。（如图1）

2.2抗体最佳标记浓度确定

取5支1.5mL离心管，每支管中加入1mL胶体金溶液，再在一支试管中加入100μL 0.01 mol/LPBS溶液做为空白对照，在其它几支离心管中各加入100μL用0.01mol/L PBS稀释不同浓度（分别为15、30、45、60 μg/mL）抗体蛋白后摇匀，然后再每隔5 min摇1min，半小时后观察颜色刚好稳定趋于不变的红色的那支离心管，其对应的蛋白添加量为最少蛋白稳定量，然后再在这个剂量的基础上加20%确定为最适蛋白标记量。如图2和表1所示，当加入抗体蛋白的量为0 mg/L时，试管中的颜色为紫色，表明加入的抗体蛋白量不足；当加入15 mg/L抗体蛋白时，试管中的颜色为紫红色，表明加入的抗体蛋白量还是不足；当加入抗体蛋白量为30 mg/L的时候，试管中的颜色刚好趋于稳定的红色，表明此刻加入的抗体蛋白量正好可以与胶体金结合，一般在最低添加量的基础上再加上20%作为实际工作用量，即36 mg/L为合适的抗体蛋白添加量。

2.3抗体标记复溶液的确定

用低温高速离心的方法纯化金标抗体，除去胶体金标记抗体溶液中的聚集物以及其它杂质，步骤如下：

①以12000 r/min，4℃离心30 min离心后去掉上清；

②用0.01 M pH7.4的PBS配制复溶液，将沉淀用各复溶液溶解至原体积，重复一次，最后离心沉淀用复溶液重悬至原体积的1/10，4℃保存备用。

2.4金标结合垫的筛选

金标结合垫种类一般有玻璃纤维膜、聚酯膜、纤维纸等，合格的金标结合垫不但要求材质稳定，易于操作，而且最重要一点是其对金标溶液有较低的非特异性吸附。本实验将SB06、GL048、Whatman33glass、Ahlstrom6613、Ahlstrom8964五种膜进行对比实验进行筛选，经过多次实验，最终选择金标抗体释放完全，且背景颜色好的Ahlstrom8964作为金标结合垫。

2.5硝酸纤维素膜上检测线和质控线的确定

用VP60蛋白标记的胶体金作为探针，用纯化的兔瘟病毒VP60蛋白按1：2，1：4，1：8，1：16浓度作为检测线和质控线试剂，在NC膜上划线，加阻性血清检测，血清中的抗兔瘟病毒抗体与SPA标记的胶体金形成复合物，由于层析作用复合物沿膜带移动，与包被在检测线上的兔瘟病毒vp60蛋白抗原形免疫胶体金复合物，富集检测线上，显示红色，最终确定按1：8稀释划线在节约材料、使用效果方面比较好，所以最终确定其检测线和质控线。

2.6检测卡的组装

将DL42玻璃纤维膜裁剪成16mm× 300mm的长条， 作为样品垫；将BL-1吸水纸裁剪成160mm×300mm的长条，作为吸水垫。首先将NC膜粘贴到PVC底板中间对应的位置上，然后将金标垫、样品垫、吸水纸等按一定的顺序、层次粘贴到PVC底板上，这样就组装成了大板，最后用切条机切割成4mm宽的细条，放进金标卡壳中，盖上盖压紧、放上干燥剂密封保存备用。

2.7检测卡的灵敏性和特异性

按实验操作，将阳性兔瘟血清按1：8稀释后，同时与其它阴性血清如肠炎和PBS溶液进行检测，结果都无色带出现，说明制作的胶体金检测卡具有良好的特异性。

3检测卡的使用

3.1用法

用吸管滴三滴全血（约100μL）或二滴血清（约60μL）进入稀释液中混匀，吸取4-5滴加入试纸卡加样孔中，1分钟后开始观察结果，1 0分钟后当红细胞在窗口中可见时终止观察，根据示意图判定结果。

3.2判定

如图3所示，在试纸卡“C”（对照线）和“T”（检测线）处均显红色，判为阳性（见图A）；只在试纸卡“C”处或“T”（检测线）显红色，均判为阴性（见图B，C）。为了对本检测卡进行验证，分别对高青、滨州等地的几个兔场进行抽样验证，一共抽取了120份血样，在现场用研制的兔瘟胶体金检测卡进行全血检测，剩余的血样返回实验室后进行血凝检测，结果如下表2所示。

从实验结果表2来看，不但是血样的阳性和阴性数能符合起来，就是的每一个血样用两种检测方法所检测出来的结果也是一一对应的，完全吻合。而從表3可以看出，用检测卡和血凝检测结果进一步验证了兔场的免疫结果，从而对兔场的免疫做指导参考。

4结论

本研究的兔瘟抗体试纸条（卡），对兔瘟血清和全血的检测效果明显，灵敏度也比较高，其检测稀释1：8时阳性效果也非常清晰，与其它类型的血清和全血无明显的阳性反应，密封好的检测卡在常温保存下，其保藏期限可达18个月，具有操作简便、快速、准确等特点，更适用于临床的现场检测、现场筛查等，从而根据检测情况，可以基本判断出整个兔场的兔瘟免疫水平，从而制定兔瘟的免疫时间、剂量，免疫程序，保证兔场的正常生产进行。