UPLC-MS/QAMS测定小鼠血浆中石斛碱及其代谢产物M-250、M-280的浓度Δ

鲁艳柳，黄思，刘浩，曾瑶，王建秋，徐亚沙，陆远富，何芋岐（遵义医学院基础药理教育部重点实验室/特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州遵义 563003）

金钗石斛（Dendrobium nobileLindl.）为兰科石斛属（DendrodiumSW.）植物，是《中国药典》明确规定的药用石斛的植物来源，又名扁金钗、扁黄草、扁草、黄草等[1]。《神农本草经》中将其列为上品，素有“千金草”之称[2]，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳、明目强身等功效[1]。现代药理学研究表明，金钗石斛总生物碱是金钗石斛的主要活性成分，具有止痛、解热作用，可以降低心率、血压，减慢呼吸，并且缓解巴比妥引起的中毒症状[3]，还具有降血糖[4]、抗白内障[5]、抗肿瘤[6]、减少细胞凋亡[7]、抗氧化[8]和抗老年痴呆[9]等作用。而石斛碱（Dendrobine）是金钗石斛总生物碱中最主要的特征性成分[1，3]，开发应用前景广阔。本课题组前期鉴定出石斛碱在人肝微粒体中的主要代谢产物有M-250、M-280[10]，本文在此基础上，采用超高效液相色谱-质谱/一测多评法（UPLC-MS/QAMS），首次建立了测定小鼠血浆中石斛碱及其代谢产物M-250、M-280浓度的方法，为进一步研究石斛碱的药动学提供了实验依据。石斛碱及其代谢产物M-250、M-280的结构图见图1。

图1 石斛碱及其代谢产物M-250、M-280的结构图Fig 1 Structures diagrams of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

1 材料

1.1 仪器

Thermo Scientific Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨MS系统和Thermo Ultrmate 3000 UPLC系统（美国Thermo Fisher公司）；Genius 1022液氮发生器（英国Peak公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；XS205电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；XW-80A漩涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Microfuge 20R高速离心机（美国Beckman Coulter有限公司）。

1.2 药品与试剂

石斛碱对照品（北京华迈科生物技术有限责任公司，批号：D990100，纯度：≥99.0%）；盐酸伪麻黄碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：171237-201208，纯度：≥99.9%）；乙腈、甲醇、甲酸均为质谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

健康SPF级C57BL/6J小鼠24只，♂，体质量18～22 g，由重庆第三军医大实验动物中心提供，实验动物生产合格证号：SCXK（渝）2012-0005，饲养温度 21～22℃，湿度56%～65%，明暗交替时间12/12 h。本实验符合遵义医学院实验动物伦理委员会的伦理学标准。

2 方法与结果

2.1 分组与给药

将小鼠随机分为空白对照组和给药组，每组12只，实验前禁食12 h，自由饮水。根据本课题组前期试验结果，给药组小鼠按60 mg/kg灌胃石斛碱[以0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液助悬]，空白对照组小鼠灌胃等体积的0.5%CMC-Na溶液，1 h后，眼眶取血0.2 mL至肝素化的离心管中，1 856×g离心15 min，分离血浆待测。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取石斛碱对照品15.52 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度，混匀，即得对照品贮备液，于4℃保存，备用。使用前以乙腈稀释，得到含石斛碱质量浓度分别为51.73、15.52、7.76、1.55、0.78、0.16µg/mL的对照品溶液。

2.2.2 内标溶液 精密称取盐酸伪麻黄碱对照品10.01mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度线，混匀，即得内标贮备液，于4℃保存，备用。使用前以乙腈稀释，得到含盐酸伪麻黄碱质量浓度为0.4µg/mL的内标溶液。

2.3 标准血浆样品的制备

分别取100µL空白血浆，加入不同质量浓度的石斛碱对照品溶液20µL，涡旋30 s，再依次加入内标溶液20µL和乙腈200 µL，涡旋30 s，15 493×g离心10 min，取上清液，即得含石斛碱质量浓度分别为912.94、456.47、91.29、45.65、9.13、3.04、0.91 ng/mL的标准血浆样品。其中，质量浓度为912.94、91.29、9.13 ng/mL的标准血浆样品为高、中、低质量浓度的质控血浆样品，均平行制备5份。

2.4 血浆样品的处理

取100µL血浆样品，加入乙腈20µL，涡旋30 s，再依次加入内标溶液20µL和乙腈200µL，涡旋30 s，15 493×g离心10 min，取上清液50 µL，进样分析。

2.5 色谱条件与质谱条件

2.5.1色谱条件色谱柱：Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～0.5 min，5%B；0.5～15 min，5%→95%B；15～17 min，95%B）；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

2.5.2 MS条件 采用可加热电喷雾离子源（HESI）的离子化方式；雾化温度：300℃；离子传输管温度：350℃；鞘气流速：35 arb；辅助气流速：15 arb；喷雾电压：3.5 kV；碰撞电压：30、40、50 eV；质荷比（m/z）检测范围：100～1 500；扫描模式：全扫描/正离子模式；全扫描模式下分辨率：70 000 FWHM。

2.6 专属性考察

取100µL空白血浆，加入200µL乙腈，涡旋30 s，15 493×g离心10 min，取上清液即得空白血浆样品。取空白血浆样品、标准血浆样品和按“2.4”项下方法处理得到的血浆样品，按“2.5”项下方法进样测定。结果显示，石斛碱（[M+H]+m/z264.195 9）及其代谢产物M-250（[M+H]+m/z250.180 1）、M-280（[M+H]+m/z280.190 6）的保留时间分别为7.76、7.73、8.11 min，空白血浆中的内源性物质不干扰石斛碱及其代谢产物M-250、M-280的测定。石斛碱及其代谢产物M-250、M-280的选择离子图见图2。

2.7 线性关系、定量下限和检测限考察

取“2.3”项下对应样品进样测定后，采用加权（1/X2）最小二乘法，以石斛碱与内标的峰面积之比为纵坐标（y），石斛碱质量浓度为横坐标（x）进行回归分析，得回归方程为y＝－10－5x2+0.043 2x+0.430 9（r＝0.999 6）。结果表明，石斛碱检测质量浓度的线性范围为9.13～912.94 ng/mL，定量下限为3.04 ng/mL，检测限为0.91ng/mL。

2.8 基质效应考察

取“2.3”项下高、中、低质量浓度的质控血浆样品，进样测定，记录石斛碱和内标峰面积，分别记为A1和B1。将空白血浆换为水，同法制备高、中、低质量浓度的石斛碱+内标溶液，均平行制备5份，进样测定，记录石斛碱和内标峰面积，分别记为A2和B2。按A1/A2×100%计算石斛碱的基质效应，B1/B2×100%计算内标的基质效应，结果见表1。

表1 基质效应考察结果（n＝5）Tab 1Results of matrix effect（n＝5）

2.9 精密度和准确度考察

取“2.3”项下高、中、低质量浓度的质控血浆样品，分别连续进样测定5次，计算日内精密度和准确度，连续测定3 d，计算日间精密度和准确度，结果见表2。

2.10 稳定性试验

取“2.3”项下高、中、低质量浓度的质控血浆样品，分别考察15℃保存24 h，－70℃保存并反复冻融3次，以及－70℃保存15 d后样品的稳定性，结果见表3。

图2 石斛碱及其代谢产物M-250、M-280的选择离子图Fig 2 Selected ion chromatogram of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

2.11 血浆样品中石斛碱的浓度

按“2.4”项下方法处理给药组小鼠的血浆样品，按“2.5”项下方法进样测定，计算血浆样品中石斛碱的质量浓度为（41.3±5.7）ng/mL（n＝12）。

表2 精密度和准确度考察结果Tab 2 Results of precision and accuracy tests

表3 稳定性考察结果（n＝3）Tab 3Results of stability tests（n＝3）

2.12 一测多评法计算血浆样品中石斛碱代谢产物M-250、M-280的浓度

按一测多评法，取“2.11”项下给药组小鼠的血浆样品，以石斛碱对照品为对照，按“2.5”项下条件进样测定，按Wk＝fs/k×[（Ws×Ak）/As]计算其代谢产物 M-250、M-280的浓度。式中，Wk为待测物质量浓度；fs/k为相对校正因子，此处为1.0；Ws为石斛碱对照品质量浓度；As为石斛碱对照品峰面积；Ak为待测物峰面积。结果显示，血浆样品中石斛碱代谢产物M-250、M-280的质量浓度分别为（493.0±73.1）、（41.4±3.0）ng/mL（n＝12）。

3 讨论

在本课题组前期研究中，通过精确相对分子质量和二级碎片离子信息，鉴定了石斛碱在人肝微粒体中Ⅰ相代谢的4个主要代谢产物M-250、M-262、M-280和M-296，以及Ⅱ相代谢的1个主要代谢产物M-440[10]。本文检测了小鼠灌胃石斛碱后，血浆中石斛碱及其主要代谢产物M-250、M-280的浓度。但获得石斛碱代谢产物的标准品，以及对其进行准确定量还存在比较大的困难。因此，本研究借鉴了天然药物质量评价中的一测多评法，以其进行两种主要代谢产物M-250、M-280的定量研究。

一测多评法对于对照品难以得到的多指标测定有其特殊的优势[11]，目前在天然药物及其制剂的质量评价中应用已较成熟，如《美国药典》34版中有25个天然药物及制剂、《欧洲药典》7.0版中有9个天然药物、2015年版《中国药典》（一部）中黄连及银杏叶提取物等的质量评价均采用该方法[12]。在多指标检测中，以某一组分的对照品为对照，建立与其他待测组分之间的fs/k（即RCF），计算其他组分的含量，公式为：fs/k＝（Wk×As）/（Ws×Ak）。式中，Wk为待测物质量浓度；As为对照品峰面积；Ws为对照品质量浓度；Ak为待测物峰面积。

结构类型相同的化合物，RCF的值往往接近1，如2015年版《中国药典》（一部）中黄连药材各生物碱的RCF值均为1.0，可直接以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量。考虑到石斛碱代谢产物M-250、M-280的结构与石斛碱十分相似，如图1，故暂定这两个代谢产物的RCF值均为1.0，并以峰面积相当的石斛碱对照品质量浓度进行计算。但上述推测还需要进一步的试验证实。

综上所述，本研究建立了一种灵敏、准确，可用于小鼠血浆中石斛碱及其代谢产物M-250、M-280的浓度测定的方法，为研究石斛碱的药动学奠定了基础。

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