18F-FAC PET/CT在体监测肾癌脂肪酸代谢动态变化

孙玉云，张 健，郑营营，顾丙新，罗建民，张建平，徐俊彦，章英剑，王明伟

1.复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，复旦大学生物医学影像研究中心，上海分子影像探针工程技术研究中心，上海 200032；

2.复旦大学核物理与离子束应用教育部重点实验室，上海 200433；

3.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234

最新统计显示，我国肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）发病率位居泌尿系统肿瘤第3位，高达6.8/10万［1］，且和经济欠发达地区相比，其发病率在经济发达地区明显较高［2］。18F-FDG作为临床最常规和广泛使用的PET/CT显像剂，其PET/CT显像诊断肾细胞癌的灵敏度仅有47%～60%，可能是由于葡萄糖代谢并非肾癌的主要代谢方式。有研究提出，肾细胞癌脂肪酸代谢异常增高，并且以脂肪酸从头合成为主［3］。近来有研究报道［4-6］，11C-乙酸（11C-acetate，11C-AC）作为一种小分子脂肪酸，其PET/CT显像可用于诊断肾细胞癌，能弥补18F-FDG PET/CT显像在肾癌诊断方面的不足。然而，由于11C半衰期很短（t1/2=20.4 min），极大地限制了11C-AC PET/CT显像在临床中的广泛应用。因此，近年来18F标记乙酸盐（18F-fluoroacetate，18F-FAC）的研究开始出现［7-8］。18F-FAC作为11C-AC类似物，并且18F具有较长的半衰期（t1/2=109.7 min），其PET/CT显像具有很大的应用前景。例如，最新的一项研究显示，18F-FAC PET/CT对低级别肾癌的检出率为82.6%，显著高于18F-FDG显像的8.7%［8］。然而，截至到目前，尚没有18F-FAC PET/CT分子影像在体监测肾癌脂肪酸代谢动态变化的研究，因而也不清楚肾细胞癌摄取18F-FAC与脂肪酸代谢之间的关系。我们课题组的前期研究发现，肾细胞癌摄取11C-AC与脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）有关［4］，而FAS正是脂肪酸从头合成途径的关键酶之一。多项基础研究发现，PI3K/AKT/mTOR为FAS的上游调控因子之一［9-11］，因此抑制该信号转导途径可以抑制FAS基因和蛋白的表达［12］。在本项研究中，我们选用mTOR抑制剂依维莫司作为干预药物，在药物处理前后的多个时间点，开展肾癌模型鼠的纵向性在体18F-FAC PET/CT显像，对比观察肾癌18F-FAC摄取和FAS表达的变化，从而探讨肿瘤18F-FAC摄取量与FAS表达量的相关性并研究18F-FAC PET/CT能否在体监测肾癌脂肪酸代谢变化。

1 材料和方法

1.1 主要实验试剂和仪器

18F-FAC由复旦大学附属肿瘤医院核医学科自制，合成方法见参考文献 ［13］。依维莫司购自大连美仑生物技术有限公司，于-20 ℃冰箱中保存，临用时取适量该药物溶于30%丙二醇（先溶解），再加入5%Tween 80及去离子水，使药物浓度为2 mg/mL。兔抗人FAS抗体购自英国Abcam公司，使用时按1∶100配比。Inveon小动物PET/CT仪器为复旦大学附属肿瘤医院核医学科拥有。

1.2 肾癌细胞培养与肿瘤模型

将人肾透明细胞癌ACHN加入DMEM培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中温育。取对数期生长的ACHN细胞，经胰酶消化后，加入10.0 mL PBS，以1 000 r/min，离心3 次，每次5 min。重新加入PBS制成细胞悬液，等待接种。

50只BALB/c裸小鼠（6周龄，雌性）购买于上海斯莱克实验动物有限公司，于右侧大腿皮下接种1×107个ACHN细胞，在SPF环境下饲养20～30 d成瘤，待肿瘤直径达到5 mm时开始进行实验。

1.3 实验设计

荷瘤鼠分为3组，分别为18F-FAC microPET/CT显像组（n=6）、免疫组织化学组（n=24）和生存期观察组（n=20）。其中每组又分为2个亚组，即实验组和对照组（图1），实验组每天给予依维莫司（10 mg/kg），连续给药14 d，对照组每天给予等体积的0.9%NaCl溶液。

图1 18F-FAC microPET/CT显像组、免疫组织化学组和生存期观察组实验设计示意图Fig1 Experimental design for longitudinal 18F-FAC microPET/CT imaging, immunohistochemistry staining and treatment protocols

18F-FAC microPET/CT显像实验中，实验组和对照组各3只ACHN荷瘤鼠，分别在第0（干预前）天和干预后第5、10和15天行18F-FAC microPET/CT显像。免疫组织化学实验中，实验组和对照组各12只ACHN荷瘤鼠，分别在第0、5、10和15天随机处死3只荷瘤裸鼠，获取肿瘤组织，进行FAS免疫组织化学染色。生存期实验中，实验组和对照组各10只ACHN荷瘤鼠，每隔1 d测量、记录荷瘤鼠肿瘤直径，依据公式V=a×b2/2计算肿瘤体积（长径记为a，短径记为b），同时观察荷瘤鼠死亡时间，记录、绘制生存期曲线。

1.4 18F-FAC microPET/CT显像

荷瘤鼠于第0、5、10和15天，经尾静脉注射7.3～9.2 MBq（200～250 µCi）18F-FAC，注射后2 h采集10 min静态PET图像和CT图像。利用仪器的工作软件Inveon Research Workshop，通过OSEM3D/MAP法重建，获得经过衰减校正后的PET/CT图像，在肿瘤部位及对侧大腿肌肉部位勾画感兴趣区（region of interest，ROI），测定每克组织放射性占注入量的百分比最大值（the maximum of the percent injected dose per gram tissue，%ID/gmax），并计算出靶本比（T/M）。

1.5 FAS免疫组织化学染色及分析

分别于第0、5、10和15天处死3只荷瘤鼠，剥离获取肿瘤组织。然后，将瘤块置于4%多聚甲醛中固定48 h，常规石蜡包埋，脱蜡，抗原修复；加入一抗（兔抗人FAS抗体，1∶100），4 ℃温育过夜；再加入HRP-山羊抗兔/鼠通用二抗（DAKO）及DAB显色剂；最后脱水封片，并显微镜检，图像采集分析（×200）。FAS阳性率=阳性区域光密度值（integral optical density，IOD）/视野面积（mm2）。

1.6 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件分析处理数据。所有定量数据均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用独立t检验。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验比较ACHN荷瘤鼠生存差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 18F-FAC PET/CT显像在体监测肾癌脂肪酸代谢随时间的动态变化

图2A是实验组和对照组肾癌模型在第0（基线）、5、10和15天的静态18F-FAC PET/CT图像，图2B和2C是对应的肿瘤组织18F-FAC摄取值%ID/gmax及其与对侧肌肉摄取值的比值（T/M）随时间定量变化关系图。对照组肾癌摄取18F-FAC随着时间明显升高，第5、10和15天的%ID/gmax分别为10.560±0.677、12.325±0.275和13.450±0.517，与基线值8.425±0.549相比差异均有统计学意义［P＜0.05（第5天），P＜0.01（第10和15天），图2A、B］。实验组肾癌组织摄取18F-FAC也随时间不断增加，但与对照组相比明显趋缓。第5、10和15天%ID/gmax分别为9.708±0.792、10.285±0.751和10.859±1.100，与基线值8.087 ± 0.792相比差异也均有统计学意义（P均＜0.01）。进一步组间比较分析发现，基线时两组肿瘤组织的18F-FAC摄取值基本相当，差异无统计学意义；而在之后的时间点实验组摄取值均明显低于对照组，差异有统计学意义［P＜0.01（第5天），P＜0.05（第10和15天）］。本研究又采用T/M值分析肾癌的18F-FAC摄取变化，获得类似的结果，即除基线值相当外，实验组T/M均显著低于对照组，且各时间点差异均有统计学意义［P＜0.01（第5和10天），P＜0.001（第15天），图2C］。18F-FAC PET/CT显像实验结果说明，肾癌摄取18F-FAC随时间及干预处理呈动态变化，且和对照组比较，依维莫司的干预可以降低肾癌的脂肪酸代谢。

图2 18F-FAC小动物PET/CT显像及定量分析Fig2 18F-FAC microPET/CT imaging and the quantitative analysis

2.2 肾癌FAS表达的变化

图3A为肾癌组织的FAS免疫组织化学染色图像，其阳性表现为棕色的细胞质染色，图3B为对应的FAS表达水平的定量计算。结果显示，对照组肾癌组织FAS表达水平随时间推移明显升高，第5、10和15天的IOD/mm2分别为0.073±0.003、0.117±0.002和0.213±0.017，与基线值0.032±0.003相比差异均有统计学意义（P均＜0.001）。实验组肾癌组织FAS表达程度随时间推移也在不断增加，但与对照组相比明显趋缓，第5、10和15天IOD/mm2分别为0.037±0.001、0.074±0.001和0.106±0.012，与基线值0.032±0.000相比差异也均有统计学意义［P＜0.01（第5天），P＜0.001（第10天），P＜0.05（第15天）］。进一步组间对比发现，基线时两组肿瘤组织的FAS的表达水平基本相当，差异无统计学意义；而在之后的时间点实验组FAS表达均明显低于对照组，然而第5天的差异无统计学意义，第10和15天的差异均有统计学意义（P均＜0.05）。免疫组织化学实验结果显示，肾癌FAS表达水平随时间及干预处理呈动态变化，与上述18F-FAC变化趋势一致，且和对照组比较，依维莫司干预可降低肾癌的FAS表达程度。

图3 FAS免疫组织化学染色及定量分析Fig3 IHC staining of FAS and the quantitative analysis

2.3 肾癌18F-FAC摄取与FAS表达的相关性

图4为肾癌18F-FAC摄取与FAS表达的相关性关系图。肾癌18F-FAC摄取（%ID/gmax）（图4A）和T/M（图4B）均与FAS表达具有良好的正向相关性（P均＜0.001）。该实验结果进一步说明，18F-FAC摄取与FAS表达具有一致的变化趋势，即FAS表达升高，18F-FAC摄取增加，反之亦然。

2.4 依维莫司处理明显抑制肿瘤体积增长和延长荷瘤鼠的生存期

我们进一步开展了肿瘤体积变化和生存期实验，以观察依维莫司干预肾癌引起的抗肿瘤效应。实验组肿瘤生长缓慢，而对照组的肿瘤生长迅速，其肿瘤体积显著增大，并且两者的体积在第9天开始差异有统计学意义(图5A)。实验组荷瘤鼠的中位生存期为35 d，而对照组仅为23 d，差异有统计学意义（P＜0.01，图5B）。该实验结果表明，依维莫司可抑制肾癌生长，延长ACHN荷瘤鼠中位生存期。

图5 依维莫司处理对肿瘤体积（A）和荷瘤鼠生存期（B）的影响Fig5 Effect of everolimus on tumor volume (A) and the survival (B) of ACHN tumor-bearing mice

3 讨 论

核素11C和18F等标记的11C-AC和18F-FAC在肾癌PET/CT显像方面具有重要的作用。自1995年Shreve等［14］首次将11C-AC用于肾脏肿瘤PET显像以来，11C-AC PET/CT在肾脏肿瘤的临床应用越来越多，认为其肾癌诊断的灵敏度明显高于18F-FDG［15-17］。近年来，有研究显示，18F-FAC PET/CT对肾癌亦有较高的诊断效能［6］。然而，到目前为止，还未见到18F-FAC PET/CT分子影像在体监测肾癌脂肪酸代谢的动态变化的报道，因而也不清楚肾癌摄取18F-FAC与脂肪酸代谢及FAS之间的关系。

本实验首先选择mTOR抑制剂依维莫司作为干预药物，将肾癌模型分为实验组和对照组，在药物干预前后的不同时间点，开展纵向性在体18F-FAC PET/CT显像和FAS免疫组织化学实验，以观察18F-FAC摄取与FAS表达的动态变化。目前，常见的有效抑制FAS表达的药物为苏氨酸和C75，然而，两者都会影响患者营养物质摄取，减轻体质量［18］，这些因素阻碍了它们的临床应用。另外，根据本课题组前期研究经验，抑制剂量的C75容易导致实验鼠死亡。依维莫司是一种mTOR抑制剂，临床上已用于肾癌的二线治疗，同时已有研究提出PI3K/AKT/mTOR是FAS上游通路［19］，可通过抑制mTOR从而抑制FAS基因及蛋白的表达，因此我们选择依维莫司作为建模干预药物。需要指出的是，为了确保实验结果不受干扰，我们设置了3个独立实验组，分别进行18F-FAC显像实验、FAS免疫组织化学实验及生存期观察实验。鉴于荷CWR22乳腺癌小鼠的18F-FAC PET/CT研究发现，在注射后2 h肿瘤与肌肉摄取的T/M比1 h高［20］，因此，我们选择注射18F-FAC后2 h开展PET/CT显像。在体小动物microPET/CT显像结果表明，实验组肾癌18F-FAC摄取明显低于对照组。相应的免疫组织化学结果发现，实验组肿瘤组织FAS表达也均显著低于对照组。Yan等［19］采用另一种mTOR抑制剂雷帕霉素同样降低了乳腺癌细胞FAS蛋白表达，与该研究结果类似。

综合18F-FAC PET/CT显像和FAS免疫组织化学实验可见，肾癌摄取18F-FAC和FAS表达均随时间呈现出动态增加的变化趋势，而实验组的增加幅度明显小于对照组。Pflug等［21］通过对转基因前列腺癌小鼠模型的研究发现，随着小鼠周龄增加及疾病进展，FAS表达呈明显上升趋势。本实验也观察到对照组肿瘤FAS表达随时间推移不断上升。有研究表明，肿瘤负荷越高，FAS表达也越高［22-23］，因此，本实验中肾癌FAS表达水平随时间推移而升高的可能原因是肿瘤负荷在不断增加，脂肪酸代谢越来越旺盛。且第5天对照组肾癌FAS表达水平明显高于基线值（2.2倍），这与前期研究结果一致［24-25］。Furuta等［24］在乏氧和存在活性氧自由基环境中（模拟肿瘤微环境），培养乳腺癌细胞，FAS基因及蛋白表达明显上调。其中在氧自由基存在条件下，12 h后MDA-MB-157乳腺癌细胞FAS mRNA表达水平增加约3倍。Lee等［25］发现在乏氧环境下，24 h后UCB-hMSC干细胞FAS表达增加2倍。此外，依维莫司处理期间FAS表达仍然缓慢增加，可能原因是抑制FAS并非依维莫司的主要药理作用［26］，FAS表达也可能受其他多种因素调节，如乙酰转移酶P300［27］。进一步的相关性分析发现，肾癌组织18F-FAC摄取与FAS表达程度之间呈显著正相关。这些都说明两者具有一致的变化趋势，即FAS表达升高，18F-FAC摄取增加，反之亦然。

我们继续开展了肿瘤体积变化和生存期实验，以观察依维莫司处理肾癌引起的抗肿瘤效应。实验组肿瘤体积较对照组明显缩小，生存期则明显延长。由此可见，依维莫司既能降低肾癌脂肪酸代谢和FAS表达，又具有明显抑制肾癌生长的作用。

本实验室的前期研究已经评估了18F-FAC人体器官的内照射剂量［28］，结果显示，全身有效剂量低于国际辐射防护委员会（International Commission on Radiological Protection，ICRP）发布的ICRP 118号报告［29］中关于个人每年最高有效剂量限值。其他研究也证明了18F-FAC的安全性，适合于人体显像［30］。由此可见，18F-FAC是安全有效的PET显像剂，其PET/CT显像在临床应用中将有广阔的前景。

综上所述，我们开展了纵向性、多时间点的在体肾癌18F-FAC PET/CT分子影像学研究，发现了肾癌摄取18F-FAC的动态变化与FAS表达的变化趋势一致，并且二者具有良好的正向相关性。因此，本研究认为18F-FAC PET/CT显像可用于在体监测肾癌脂肪酸代谢动态变化，也有望用于靶向抗脂肪酸代谢药物的疗效评价。

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