青海极端生境植物根围促生菌分离鉴定及生物活性分析

吴晓晖 谢永丽 梁欣 张英 芦光新

摘要：通过平板对峙试验以分离筛选自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖盐碱地、海北爆轰试验场3个极端生境植被根围的菌株为供试菌株，进行拮抗活性检测；采用16S rDNA及gyrB基因序列分析鉴定菌株；采用CMC法及Gram染色法测定菌株降解纤维素活性；对具降解纤维素活性的拮抗菌株进行促生活性测定。结果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5分别对油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）、小麦长孢蠕菌（Helminthosporium tritici-vulgaris）具有拮抗活性，抑菌圈平均直径均>20 mm。3株菌株均被鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均具降解纤维素及促植物生长活性。

关键词：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；分子鉴定；降解纤维素活性；拮抗活性；促生

中图分类号：Q948.12+2.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）08-0061-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.016

Isolation and Identification of Growth-promoting Rhizosphere Strains Isolated from Extreme Environment and Its Biological Activity Analysis

WU Xiao-hui，XIE Yong-li，LIANG Xin，ZHANG Ying，LU Guang-xin

（College of Agricultural and Animal Husbandry，Qinghai University/Key Laboratory of Altiplano Grassland Resource and Ecology，Province and Education Ministry，Xining 810016，China）

Abstract： The strains were isolated from three representative extreme sample area including Tuogeruoge semi-desert sand，Tuosu Lake salt and alkali land，detonation test site of Haibei in Qinghai province. Antagonistic activity detection was used to check antagonistic activity of these strains. Polyphasic molecular taxonomy methods including gyrB and 16S rDNA partial sequence analysis were used to identify these strains. The CMC plate test and Gram staining method were used to analysis cellulose degradation of the bio-control strains. The results showed that three strains including TGRG3，TGRG7 and TSH5 could present distinct antagonistic activity to Sclerotinia sclerotiorum，Fusarium graminearum and Helminthotporium tritici-vulgaris，and diameters of the inhibition zone were all longer than 20 mm. The strains of TGRG3，TGRG7 and TSH5 were identified as Bacillus subtilis. All of three biocontrol B. subtilis strains had cellulose-degradation activity and promotion function on growth of plant.

Key words： Bacillus subtilis； molecular identification； cellulose-degradation activity； antagonistic activity； growth-promoting

芽孢杆菌（Bacillus spp.）革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧，能产生耐热、耐盐碱、耐紫外等内源芽孢，环境适应性强，分布于各种环境中，在农牧业、工业和医学研究等方面扮演着极其重要的角色[1]。芽孢杆菌作为根围促生菌（Plant Growth-promoting Rhizobacteria，PGPR），其促生机制包括提高植物根际营养的可利用性，促进难溶性磷、铁和微量元素的吸收；产生植物激素类物质有赤霉素（Gibberellins）、吲哚-3-乙酸（IAA）、细胞分裂素（Cytokinin）等。此外，还可通过抑制病原物、诱导植物抗病性来间接促进植物生长[2]。部分芽孢杆菌能够固氮、溶磷，对土壤有机质进行分解，从而提高土壤肥力，促进土壤营养元素循环；部分芽孢杆菌能产生胞外纤维素酶、半纤维素酶等，能够有效降解木质纤维素[3，4]。芽孢杆菌是当前研究应用较广的一类微生物资源。

草场是以土壤-牧草-家畜为主体形成的生态系统，在该系统中，微生物對土壤、牧草和家畜都起着至关重要的作用[5]。青海省地域环境特殊，秋冬季节草场枯黄，饲料来源紧张，若将能产生降解木质纤维素酶类的生防芽孢杆菌菌源应用于饲料加工生产，通过芽孢杆菌分泌的高效纤维素降解酶加速草料降解，使草料养分有效释放，提高牲畜对营养的消化吸收效率，是畜牧业发展的有效途径[6]。

青海省为“三江之源”，是重要的农牧业大省，特殊生境决定其生态环境保护的差异性。因此，减少化学农药的使用，可降低其对人类健康、生态环境及粮食安全构成的严重威胁，而开发绿色天然、对环境友好的生物菌肥应用于生态环境保护、植被退化恢复，显得尤为重要[6]。芽孢杆菌抗菌防病机制主要包括拮抗与竞争作用、诱导植物抗病性。生防细菌最主要的抗菌机制是核糖体合成的细菌素、几丁质酶和葡聚糖酶等抗菌蛋白以及次生代谢产生的抗生素与挥发性抗菌物质产生的拮抗作用。芽孢杆菌抑制植物病原菌的范畴很广，包括根、茎、叶、花及果实病害，使其在植物病害生物防治中具有潜在的应用价值[7]。芽孢杆菌对环境友好、对人畜安全，是理想的生防菌筛选菌源，也是理想的生物农药和生物菌肥的研发菌源，对生态农牧业的发展有重要意义。

以分离自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖盐碱地、海北爆轰试验场极端生境的植物根围菌为供试菌株，通过平板对峙试验测定菌株拮抗活性；16S rDNA及gyrB基因序列分析鉴定菌株；CMC平板法和Gram染色法测定菌株降解纤维素的能力，测定供试菌株促植物生长活性，为青藏高原农业、畜牧业及饲料加工产业提供了适应高原生态环境的可利用菌源。因此，探究草地生态系统中微生物功能，合理发掘利用微生物资源，对草地生态系统可持续发展具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

供试芽孢杆菌菌株分离自青海托格若格半荒漠沙地骆驼蓬（Peganum L.）根围、托素湖盐碱地带野生黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr）根围、海北爆轰试验场高山嵩草草甸（Kobresia pygmaea）根围；病原指示菌油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum de Bary）、小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）、小麦长蠕孢菌（Helminthosporium tritici-vulgaris）由青海大学高原草地资源与生态省部共建实验室保存；小麦（Triticum aestivum Linn）种子（高原448号）由青海省农林科学院馈赠。

细菌培养LB（Luria-Bertani）培养基、真菌培养PDA（Potato Dextrose Agar）培养基、CMC-Na培养基配制参考文献[8]配制。

引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成；PCR扩增反应试剂dNTP Mixture（CD117）购自北京天根生化科技有限公司；基因组序列测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 土样采集及菌株分离 土样采自青海托格若格半荒漠沙地骆驼蓬根围、托素湖盐碱地带野生黑枸杞根围、海北爆轰试验场高山嵩草草甸根围。采用五点取样法，用小铲除去表土，取植物根部5～25 mm处土样，装入采样袋内，标记好采样植被、时间、地点等[9]。菌株分离采用平板稀释法，称取5 g土样，将土壤研磨成粉末状，放入45 mL生理盐水中，摇床振荡30 min，静置使之澄清；用无菌水将其稀释为10-1、10-2、10-3 3个浓度梯度，将稀释液80 ℃金属浴10 min后取出。吸取各浓度稀释液200 μL涂布于LB固体培养基平板中，倒置于恒温箱中，37 ℃过夜培养，挑取单菌落于新LB培养基中，37 ℃恒温培养；挑取形态不同的单菌落接种于液体LB培养基中，37 ℃摇床过夜振荡培养，用平板划线分离法纯化，直至获得纯培养[9]。

1.2.2 拮抗病原真菌活性测定 分别将26 ℃培养箱中活化后的油菜菌核病菌、小麦赤霉菌、小麦长孢蠕菌PDA平板边缘打取直径为0.7 cm的菌碟， 接种在新PDA平板中央。在距离菌块2.5 cm处3个接种点上放置直径为4 mm的滤纸小圆片，吸取5 μL 37 ℃、200 r/min条件下培养14 h的芽孢杆菌菌液，接种于滤纸片上，每个处理重复3次，放入26 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，取出观测并记录抑菌结果[10]。

1.2.3 菌株分子鉴定 通过16S rDNA基因序列分析鉴定菌株，以菌株基因组DNA为模板扩增16S rDNA基因，正向引物127F：5′-AGAGTTTGATCMTG

GCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GCYTACCTTGTT

ACGACTT-3′。PCR扩增条件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 8 min；4 ℃ 10 min。将扩增产物测序，所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对[11]。

通过gyrB基因序列分析鉴定菌株，以菌株基因组DNA为模板扩增gyrB基因，正向引物gyrB-For：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3′，反向引物gyrB-Rev：5′-AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGT CAT-3′。PCR扩增条件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 8 min；4 ℃ 10 min。将扩增产物测序，所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对[12]。

1.2.4 菌株降解纤维素活性测定 在CMC筛选培养基平板上设置3个接种点，放置直径为4 mm的滤纸小圆片。将供试菌株在LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min条件下振蕩培养12 h，取菌液5 μL于滤纸片中央，每个处理重复3次，将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养2 d，将革兰氏碘染液（Gram iodime）注入并淹没平板表面，盖上平皿盖，静置4 min后，倒去染液，观测并记录结果。测定并记录透明圈直径、菌落直径，并计算两者比值A[13]。

1.2.5 菌株促生活性测定 选择种皮完好的小麦种子（高原448号）在20%次氯酸钠溶液中消毒处理20 min，无菌水冲洗3～4次；将种子在菌悬液中浸种24 h（菌悬液稀释浓度106 CFU/mL），无菌水处理作对照；将浸种后的种子播于铺有滤纸的培养皿中，置于光照培养箱中培养（28 ℃，光周期16 h/8 h），培养5 d后观察种子的萌发情况，测定芽长、根长和鲜重，统计芽孢杆菌对植物的催芽效果；每个处理重复3次，每个重复选50粒种子进行测定和记录[9]。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌分离

在菌株分离过程中，土壤稀释液经80 ℃金属浴10 min，普通细菌被灭活，而芽孢杆菌为适应高热环境而形成孢子，通过LB培养基培养初步分离得到。从青海托格若格半荒漠沙地、托素湖盐碱地、海北爆轰试验场共分离到500余株菌株，根据不同的菌落形态，分别从托格若格样点选择10株菌株，托素湖样点选择10株单菌落，海北爆轰试验场样点选择6株细菌单菌落进行纯化培养（图1）。

2.2 拮抗病原真菌活性

将分离的16株菌株多次转接，选择其中活性强的7株作为供试菌株，分别命名为BHC1、BHC4、BHC5、TGRG3、TGRG7、TSH5、TSH6。以油菜菌核病菌、小麦赤霉菌、小麦长孢蠕菌为病原真菌指示菌，检测菌株拮抗病原真菌活性。结果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5对3种病原真菌均具有明显的拮抗病原真菌活性，抑菌圈直径>20 mm（表1）。

2.3 菌株分子鉴定

2.3.1 16S rDNA序列分析 以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5基因组DNA为模板，扩增16S rDNA基因片段，扩增到大小约1 300 bp的PCR特征性条带（图2）。將PCR产物测序结果在NCBI中，用BLAST软件与GenBank中己知序列进行比对。结果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5与芽孢杆菌B. subtilis ATCC49760（登录号：CP014840.1）的16S rDNA序列同源性皆为99%。

2.3.2 gyrB基因序列分析 以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5基因组DNA为模板扩增gyrB基因片段，扩增到大小约1 300 bp的PCR特征性条带（图2）。将PCR产物测序结果在NCBI中，用BLAST软件与GenBank中己知序列进行比对。结果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5与枯草芽孢杆菌B. subtilis ATCC49760（登录号：CP014840.1）的gyrB基因序列同源性分别为97%、96%、98%（表2）。

2.4 降解纤维素活性

以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5作为供试菌株，检测菌株降解纤维素活性。结果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5可在以纤维素为惟一碳源的CMC-Na培养基上，分别形成直径为13.0、14.3、14.3 mm的降解透明圈，D/d（透明圈直径D与菌落直径d之比）分别为2.06、2.04、1.96，表现出降解纤维素活性。菌株降解纤维素的活性A与D/d呈正相关，即D/d越大，菌株降解纤维素活性越强（图3、表3）。

2.5 菌株促生效果测定

将菌株TGRG3、TGRG7、TSH5发酵液分别制备成细胞浓度为1×106 CFU/mL的菌悬液，对小麦进行浸种处理，以无菌水浸种作为对照，播种培养5 d后统计小麦幼苗根长、芽长及鲜重。结果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌悬液处理后的小麦芽长与对照组相比分别增长6.50%、1.45%、2.89%。菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌悬液处理后小麦根长较对照分别增长33.49%、3.52%、12.05%；菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌悬液处理后小麦鲜重较对照分别增加30.00%、15.31%、23.05%。其中，菌株TGRG3菌悬液对根长的促生效果尤为显著（表4）。

3 讨论

青藏高原强烈的地形变化、独特的大气环流和气候的多样性，提供了多样性的生物栖息环境，为极端微生物资源的研究开发及应用提供了平台[14]。本研究以分离筛选自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖盐碱地带、海北爆轰试验场3个极端生境植物根围菌为供试菌株，以油菜菌核病菌、小麦赤霉菌、小麦长孢蠕菌为病原指示菌，测定供试菌株的拮抗活性。结果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5对3种病原真菌均具有明显拮抗活性，抑菌圈直径均大于20 mm。

16S rDNA和gyrB基因常被用于细菌鉴定，利用核糖体16S rDNA基因序列保守区域设计引物，此引物能与多数种属的核糖靶位点结合[11]；gyrB即促旋酶（gyrase）的B亚单位基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第3位碱基，使gyrB基因序列在区分鉴定细菌近缘种方面较非蛋白编码基因16S rDNA更精确[12]。本研究对菌株TGRG3、TGRG7、TSH5进行16S rDNA及gyrB基因序列分子鉴定，综合两种鉴定结果，3株菌株均被鉴定为枯草芽孢杆菌。对菌株TGRG3、TGRG7、TSH5进行促生效果测定，与对照相比，3株菌株对高原小麦品种的芽长、根长和鲜重均有不同程度的促生效果，其中菌株TGRG3对根长的促生效果最为显著。3株菌株分离筛选自高原极端生境，可促进植物生长、提高地上生物量，在高原植被恢复、生态农业发展方面具有一定的应用潜力[15]。CMC平板及Gram染色法检测菌株降解纤维素活性，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5可在以纤维素为惟一碳源的培养基上正常生长，表明菌株可产生纤维素降解酶，表现出明显的纤维素降解活性。在饲料加工生产及作物秸秆还田中，若利用生防菌株分泌产生的纤维素降解酶来加速草料或秸秆木质纤维素的降解，可使饲料营养物质降解为容易被牲畜吸收利用的单糖、寡糖成分，使养分得到更有效的释放[16]，对饲料加工生产、农田土壤结构和肥力的改善都有重要意义[17]。

本研究分离筛选自青海极端生境的枯草芽孢杆菌菌株适应高原特殊生境，兼具拮抗活性、降解纤维素活性及促生活性，可作为生物菌肥和生物农药的研发菌源，并可作为饲料加工生产中改善饲料木质纤维素降解的有益菌源，在农牧业生产及饲料加工中具有一定的研究及应用潜力。

参考文献：

[1] 谢永丽，马莉贞，徐志伟，等.青海柴达木极端干旱沙地分离芽孢杆菌的分子鉴定及拮抗活性分析[J].微生物学通报，2012，39（8）：1079-1086.

[2] 黄 曦，许兰兰，黄荣韶，等.枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展[J].生物技术通报，2010（1）：24-29.

[3] 李红亚，李术娜，王树香，等.解淀粉芽孢杆菌MN-8对玉米秸秆木质纤维素的降解[J].应用生态学报，2015（5）：1404-1410.

[4] 王 毅，刘云国，习兴梅，等.枯草芽胞杆菌降解木质纤维素能力及产酶研究[J].微生物学杂志，2008，28（4）：1-6.

[5] 馬玉寿，张自和，董全民，等.恢复生态学在“黑土型”退化草地植被改建中的应用[J].甘肃农业大学学报，2007，42（4）：91-97.

[6] 李红亚，李 文，李术娜，等.解淀粉芽孢杆菌复合菌剂对玉米秸秆的降解作用及表征[J].草业学报，2017，26（6）：153-167.

[7] 陈中义，张 杰，黄大昉.植物病害生防芽孢杆菌抗菌机制与遗传改良研究[J].植物病理学报，2003，33（2）：97-103.

[8] 谢永丽，高学文.高寒草甸根围拮抗芽孢杆菌筛选鉴定及脂肽化合物分析[J].中国生物防治学报，2012，28（3）：367-374.

[9] 薛鹏琦，刘 芳，乔俊卿，等.油菜菌核病生防芽孢杆菌的分离鉴定及其脂肽化合物分析[J].植物保护学报，2011，38（2）：127-132.

[10] 杨琦瑶，索雅丽，郭荣君，等.枯草芽孢杆菌B006对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌组分分析[J].中国生物防治学报，2012，28（2）：235-242.

[11] 刘朝军，沈定霞.16SrDNA序列测定在细菌鉴定中的应用[J].军医进修学院学报，2011，32（7）：774-776.

[12] 安 然，易图永，肖启明，等.gyrB基因在细菌分类和检测中的应用[J].江西农业学报，2010，22（4）：18-20，24.

[13] 颜 霞，秦 魏.降解纤维素真菌的分离筛选及其环境适应性初探[J].中国农学通报，2008，24（5）：44-49.

[14] 刘 玉，马玉寿，李世雄，等.青海湖北岸不同类型退耕还草地群落物种多样性和生物量特征研究[J].西北农业学报，2014， 23（1）：48-52.

[15] 张 霞，唐文华，张力群.枯草芽孢杆菌B931防治植物病害和促进植物生长的作用[J].作物学报，2007，33（2）：236-241.

[16] 张 楠，杨兴明，徐阳春，等.高温纤维素降解菌的筛选和酶活性测定及鉴定[J].南京农业大学学报，2010，33（3）：82-87.

[17] 崔海洋，程仕伟，黄田红，等.产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌分离鉴定及酶学性质研究[J].食品科学技术学报，2014，32（3）：43-47，53.