阿司匹林肠溶片2015年药典微生物限度检查法的建立及方法学验证

（云南省药物研究所 云南 昆明 650111)

杜春华 李东娴 和东阳 普冰清 牛延菲 游燕（通讯作者）

阿司匹林，主要成分为2-（乙酰氧基）苯甲酸，最早用于解热、镇痛、抗炎，在临床上，能够对于感冒发热、头痛牙痛以及关节风湿疾病等患者起到较好的镇痛效果，类别为：解热镇痛、非甾体抗炎药、抗血小板聚集药[1]-[4]。根据2015版药典要求，为了确认所采用的方法适合用于某制剂的微生物限度检查，必须对相应检验方法进行方法学验证。李秋菲等[5]按照中国药典2005年版一部对阿司匹林缓释片的微生物限度建立并验证了检查方法，发现其具有很强的抑菌作用，现在笔者通过2015年新版药典建立阿司匹林肠溶片微生物限度检查方法及方法验证。

1.仪器与材料

1.1 仪器

隔水式电热恒温培养箱（型号：GSP-9160MBE，上海博迅实业有限公司），生化培养箱（型号：LRH-150，上海一恒科学仪器有限公司），匀浆仪（型号：JT-C，漯河海德实验设备有限公司），二级生物安全柜（型号：BSC-1100ⅡB2-X，济南鑫贝西生物技术有限公司）

1.2 试药

1.2.1 供试品 阿司匹林肠溶片。

1.2.2 培养基

胰酪大豆胨液体培养基，批号170310；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号1706282；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号170608；沙氏葡萄糖液体培养基，批号3106032；

麦康凯琼脂培养基，批号160303；麦康凯琼液体培养基，批号161228；pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号1705184。（沙氏葡萄糖液体培养基来源于广东环凯微生物科技有限公司，其余培养基均来源于北京三药科技开发公司。）

1.2.3 pH试纸 pH精密试纸（6.4-8.0）、pH广泛试纸（1-14）均购于上海三爱思试剂有限公司。

表1 需氧菌总数计数方法学验证结果

表2 霉菌和酵母菌总数计数方法学验证结果

1.3 试验菌株

铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、黑曲霉［CMCC(F)98003］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］，上述5种菌种都来源于中国食品药品检定研究院。

2.方法与结果

阿司匹林肠溶片按《中国药典》2015版规定，需检查需氧菌总数，霉菌和酵母菌总数，控制菌检查大肠埃希菌。

2.1 菌液制备

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的的制备参照新版药典通则1105。制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

2.2 供试液制备

取供试品10g，放入已灭菌的匀浆杯中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50ml，匀浆至供试品均匀分散，用30%碳酸钠溶液，广泛和精密pH试纸调节供试品溶液pH至6.7，然后加缓冲液补足至100mL，即得1∶10的供试液。再逐级稀释为1∶20供试液。

3.方法适用性试验

3.1 需氧菌总数计数方法适用性试验

试验组：取1∶20供试液9.9ml于灭菌试管中，加入制备好的5种阳性菌液0.1ml，使其终浓度为每1ml含菌落数小于100cfu的菌液，从试管中吸取1ml注入灭菌平皿中，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，待其凝固后，倒置于恒温培养箱中30～35℃培养48h。每个菌种平行制备2个平皿，测定试验组的菌落数。

供试品对照组：取1∶20供试液9.9ml于灭菌试管中，加缓冲液0.1ml，后续操作同试验组。

菌液对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液9.9ml于灭菌试管中，加入制备好的5种阳性菌液0.1ml，其余按试验组操作。

中和剂组：取30%碳酸钠稀释剂1ml，平行制备2个平皿，倒入胰酪大豆胨琼脂培养基混匀。

中和剂对照组：取30%碳酸钠稀释剂溶液9.9ml，加入试验菌悬液0.1ml，摇匀，其余按试验组操作。

阴性对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml至平皿中，平行制备2个平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。

计数方法适用性试验中，试验组菌落数-供试品对照组菌落数/菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；中和剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在0.5～2范围内，结果见表1。

3.2 霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验

取1∶10供试液9.9ml于灭菌试管中，加入制备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，其余操作同需氧菌总数计数方法适用性试验，培养基为沙氏葡萄糖琼脂，培养温度20～25℃，培养时间为72h，结果见表2。

3.3 控制菌检查方法的验证

试验组：取调过pH值的1∶10的供试液10mL至100mL胰酪大豆胨液体培养基中，再加入小于100cfu 的大肠埃希菌 1mL，其余操作和结果判断按2015版药典通则1106进行。阴性对照组：取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 1mL 按大肠埃希菌检查法操作。试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照组不得检出。试验结果表明，大肠埃希菌检查可采用常规法。

4.讨论

新版药典要求将试验菌加入供试液中，进行挑战试验，从而更加客观地考察了微生物在整个试验过程中所受的影响[6]。本研究采用30%碳酸钠溶液调节供试液的pH值呈中性后，取试验要求浓度的供试液9.9ml于灭菌试管中，加入制备好的试验菌菌液0.1ml，使其终浓度为每1ml含菌落数小于100cfu的菌液进行后续试验，通过三次验证的试验结果表明，药典规定验证用5种试验菌株的比值均在0.5～2范围内，阿司匹林肠溶片微生物限度检查可依据上述试验方法进行。

《中国药典》2015年版提出[7]，若试验中使用了中和剂，那么应设立中和剂对照组，以此来确认所使用的中和剂不影响污染微生物的生长。本研究中采用了30%碳酸钠溶液作为中和剂，用于调节其pH值，可以消除供试品的抑菌性。笔者在做试验设计时，做了中和剂组和中和剂对照组，且二者的菌落数比值在0.5～2之间，说明30%碳酸钠稀释剂不影响污染微生物的生长。

[1] CHAN T-A,MORIN P J,VOGELSTEIN B,et al. Mechanisms underlying nonsteroidal antiinflammatory drug-mediated apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci US A,1998, 95(2):681-686.

[2]李才正，苗佳.阿司匹林的临床应用进展[J].华西医学，2012，27（7）:988-991.

[3]许桂萍，马热也木·克日木.阿司匹林的药理特性及其临床应用[J].中国农村卫生2015(14):28-29.

[4]国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京：中国医药科技出版社，2015:545.

[5]李秋菲，周志云，罗世书.阿司匹林缓释片微生物限度检查方法验证[J].安徽医药，2008，12(12):1240-1241.

[6]徐晓洁，冷佳蔚，王志宏，丁勃.具有抗菌活性的中药固体制剂微生物限度检查计数方法研究[J].中国药事，2015，29（9）:946-950.

[7]国家药典委员会.中国药典[S].四部.北京：中国医药科技出版社，2015:142.