电化学功能核酸生物传感器在转基因食品检测中的发展现状

本文从转基因食品的概念出发，对转基因的发展及其所引发的安全风险进行了简要说明，然后对转基因食品的检测方法进行了简单的阐述，并着重介绍了目前电化学功能核酸生物传感器方法检测转基因的发展，最后，对将来的检测方向进行了展望。

1转基因作物的发展历程

转基因生物（genetically modified organisms，GMOs）是指利用基因工程技术将某些外源性的基因转移到动物、植物或微生物体内，与生物体自身的基因进行重组后得到稳定的遗传表达，进而获得满足人类不同需求的新的生物体。以转基因生物作为原料或初级产品进行生产加工而得到的食品即为转基因食品。

新事物的产生往往会引起公众的热议，尤其是与人类生存密切相关的饮食问题，因此，自转基因技术问世以来，不仅有民众反对，更有商业公司以及科学家反对。1972年，EMBO（欧洲分子生物学组织）工作会议首次专门讨论了重组DNA的潜在危害，此后，更有各种相关组织机构对转基因技术提出质疑并作出规定，比如《卡塔赫那生物安全议定书》。新技术的产生从来都不是一帆风顺的，虽然转基因技术受到多种限制，但一系列的转基因产品依旧问世，如转基因玉米、转基因水稻、转基因马铃薯、转基因番茄等，随之而来的是一系列的转基因安全事件，比如英国的Puztai事件、美国的班蝶风波、加拿大的超级杂草事件、墨西哥的玉米事件和中国湖北转基因水稻非法种植事件等。

1983年第一例转基因植物——烟草在美国问世，自此人类对转基因技术的研究逐步走向深入。1986年，Switzerland批准第一例转牛凝乳酶基因工程微生物的商业化应用揭开了转基因生产的序幕。1994年，美国Calgene公司开发的延熟番茄Flavr-SaV rTM被批准进行商业化生产，该产品成为全球首次批准的可进行商业化生产的转基因植物，转基因作物开始批量种植。截止到2015年，全球转基因植物的种植面积达1.8亿公顷，其中美国等西方国家转基因农作物的种植约占全部农作物的90%以上。

在已有的生物体内引入其原本没有的遗传物质，这件事情对于很多民众来说是无法接受的，尤其是对于部分宗教信仰者，他们甚至觉得这有悖常理。但是转基因技术对于解决饥饿问题，以及很多偏远地区的膳食营养问题至关重要。此外，转基因在农业、医疗等领域的应用前景非常广泛。因此，对于转基因食品的安全性评价显得至关重要。

2 传统的转基因检测方法

当前，对转基因食品的检测主要有两种方法——间接检测和直接检测，前者是指对所转入的目的基因表达出的特异性外源蛋白进行检测，后者是对所转入目的基因的检测。

2.1 基于外源蛋白靶标的检测技术

基于外源蛋白靶标的检测技术主要是以免疫分析技术为基础，利用转基因作物产生的特定外源蛋白与抗体的特异性识别进行检测和定量。

2.1.1 酶联免疫吸附技术（ELISA）

该技术采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定，该方法已可成功用于转基因水稻、大豆的检测。

2.1.2 蛋白质印迹技术（Western Blot）

蛋白质印迹技术是一种蛋白质转移电泳技术，其原理是把经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的目的蛋白原位固定于固相膜上，再用高浓度的蛋白质溶液孵育固相膜，然后用含有放射性标记或酶标记的特定抗体进行杂交，使抗原-抗体特异性结合，最后通过放射自显影或显色，观察外源基因的表达，根据检出结果可得知目的蛋白是否表达、浓度及分子量大小。

2.1.3 免疫层析试纸条技术

将特异的抗体交联到试纸条和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再与带有颜色的特异抗体反应，形成三明治状的色带，如果没有抗原，则无颜色反应。

2.1.4 蛋白质芯片技术（protein chip）

继基因芯片技术后发展起来的生物检测技术——蛋白质芯片技术，其将已知序列的蛋白、多肽分子、抗原、抗体、酶等以预先设计的方式固定在硝酸纤维素膜、玻璃、硅片等载体上排列，待荧光标记的靶分子和探针分子结合后，利用激光扫描系统对荧光信号进行强度检测分析。

2.2 基于外源DNA靶标的检测技术

核酸特别是DNA，由于其具有较高的稳定性及以DNA为靶标的检测技术具有较高灵敏度和特异性，被广泛应用于转基因成分检测实践中。依据所检测转基因核酸成分的靶序列位置及序列特征，将基于外源核酸成分的转基因检测技术按特异性由高到低分为核酸成分篩查技术、基因特异性检测技术、构建特异性检测技术及转化事件特异性检测技术。

2.2.1 定性PCR检测技术

普通PCR技术是转基因检测中常用的定性检测技术，目前，该方法除被广泛应用于转基因植物及其产品转基因成分标准化检测外，还被应用于新的转基因成分的鉴定研究中。

2.2.2 定量PCR检测技术

定量PCR技术主要分为3大类：基于终点检测的传统定量PCR技术、定量竞争PCR技术（QC-PCR）和实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）。

2.2.3 等温扩增基因芯片技术

该技术是在转基因检测中，将目前使用的报告基因、启动子、终止子的特异性片断制成检测芯片，与待测产品的DNA进行杂交，扫描信号后经计算机软件分析，进而实现对生物样品快速、高效的检测。

2.2.4 数字PCR

数字PCR技术又称单分子PCR技术，是近年来发展迅速的一种核酸绝对定量技术。

3新型电化学功能核酸传感器在转基因食品检测中的应用

上述方法中，无论是基于外源蛋白的靶标技术还是基于外源基因的靶标技术，都既需要昂贵的仪器设备，还要求操作人员具有很高的专业技能，只有这样才能满足对于转基因食品检测的精确度及准确度的要求。因此，便携性、人工智能化以及可以用于现场检测的检测设备就显得十分重要。

目前，电化学功能核酸传感器以其快速、灵敏、操作简单等优点备受广大研究人员的青睐，对于电化学功能核酸传感器的研究也在逐年增多。电化学功能核酸生物传感器是以功能核酸作为识别元件，并利用PCR、HCR、RCA或一些纳米材料作为信号放大手段，将靶物质的存在与否通过电信号的改变输出，并通过信息软件处理获得更加直观的效果。

Sun等人将硫化铅纳米粒子（PbS NPs）用作电化学检测花椰菜花叶病毒序列35S（CaMV 35S）启动子的寡核苷酸标记。PbS NPs用巯基乙酸修饰，易与CaMV 35S寡核苷酸探针连接。将目标DNA序列共价连接在巯基乙酸自组装金电极上，在电极表面完成目标DNA与探针DNA的杂交。PbS NPs锚定在杂交体溶解在硝酸氧化溶液，并采用敏感差分脉冲阳极溶出伏安法检测。该方法可以用来检测杂交反应，其检出限为 4.38×10- 1 2mol/L。

Ahmed等人首次报道了一种高效、准确且廉价的快速检测系统，该系统采用了等温扩增，随后通过电化学系统分析未纯化的扩增子的整合。在该实验中，循环介导的等温扩增（LAMP）效率比恒定温度（65℃）下进行的PCR高。将扩增产物与氧化还原活性分子Hoechst 33258合并，并通过DNA棒，使用线性扫描伏安法与一次性电化学印刷芯片集成。H33258分子与DNA小沟结合导致H33258的氧化峰电流显著下降，H33258诱导的DNA结合现象，除了阳极电流峰的变化外，还用于检测玉米CBH 351品种。由于不需要繁琐的探针固定，扩增和检测都在一台设备上进行，因此生物传感器消除了潜在的交叉污染，相信这种类型的传感器将有效提升食品安全水平。

Mix等人通过方波伏安法（SWV）证实了一种用于实际玉米面粉样品中的转基因玉米的电化学检测的方法。在用四氧化锇联吡啶标记不对称PCR扩增的靶标后，将它们与固定的寡核苷酸探针在金电极上杂交，可以检测到近等基因玉米中的玉米基因ivrp和SSIIb。在所有转基因玉米样品中检测到转基因cryIA/b和MON810特异性片段，混合样品中低至含有MON810的0.6%。尽管在杂交时间小于10分钟后可以检测含有100%近等基因或分别检转基因玉米的样品中的所有序列，但是对于检测仅含有0.9%～0.6%的转基因玉米杂交时间为30分钟。

Liao等人提出了一个生物分子分析系统构建不同的生化活动，即以加快GMOs的计算机检测，而计算机制为转基因生物筛选中常见的复杂程序提供了一种替代方法。鉴于生物分析系统能够处理启动子、编码基因和物种基因，所以在电化学和光学方式方面能成功地识别特定的GM事件。生物分子计算检测表现出低于亚纳摩尔水平的基因修饰DNA的检测能力，并且通过非GM基因的大量共存而发现无干扰。此外，这种生物分析系统以排列方式进行复杂的操作，对可变的GM事件进行多重筛选。这样一种生物分子计算方法和生物传感器对转基因生物的快速、经济和高保真筛选具有很好的前景。

Manzanares-Palenzuela等人报告了一个简单而灵敏的多元电化学方法用于抗除草剂草甘膦大豆（RRS）的定量检测。两种DNA序列通过杂交到磁珠上进行定位，通过在单个管中进行固定化、杂交和标记步骤以及并行电化学读数同时检测两个序列。使用异硫氰酸荧光素（FITC）或地高辛（Dig）标记的信号传导探针以夹心形式进行杂交，然后分别使用与过氧化物酶或碱性磷酸酶缀合的抗-Dig和抗-FITC的Fab片段进行双酶标记，在丝网印刷的碳电极上最终进行酶活性的电化学测定。测定的线性范围为2～250pM，两种目标物的检测限分别为650fM和190fM。结果表明，该方法可应用于低于欧洲标记阈值水平（0.9%）的转基因生物量化，为食品中特定转基因事件的快速定量提供了一种通用方法。

Huang等人首次描述了基于多标记的电化学生物传感器，用于在相同的传感界面上同时检测转基因产品的多种DNA成分。通过核酸外切酶催化反应和基于金纳米颗粒的生物条码相关策略分别应用两轮信号放大。使用这种电化学生物传感器，成功地实现了同时多次检测不同转基因组DNA的成分。此外，该方法的稳定性和有效性通过应用于各种GMO产品（包括当地获得并确认的商业转基因种子和转基因植物）而得到证明。他们所提出的电化学生物传感器表现出独特的优点，有希望获得更多关注，其可用于快速和现场同时多重筛选转基因产品的不同组分。

Tam报道了基于单层碳纳米管的生物传感器用于GMO检测：使用以电化学电极和单层碳纳米管场效应晶体管（SWCNT-FET）为基础的生物传感器来测定Roundup Ready大豆的CaMV 35S启动子。在最佳条件下，这两种生物传感器都可以有效检测到浓度低至1nM的样品。基于电极的生物传感器的灵敏度约为0.6千欧/nM，而基于SWCNT-FET的生物传感器的灵敏度为0.32nA/nM。两种生物传感器也用于确定PCR扩增的样品。结果表明，两种传感器都能很好地鉴定转基因生物，从而为食品样品的筛选分析提供有用的工具。

Wang等人通过识别CaMV 35S启动子报告了一种简单的无标签电化学阻抗式DNA生物传感器，用于转基因大豆检测。在检测系统中，采用Au NPs修饰的多壁碳纳米管还原氧化石墨烯纳米带来固定探针ssDNA，当通过杂交反应将目标DNA固定在修饰电极表面上时，由于形成的双链DNA抑制电子转移过程，阻抗信号显示增长趋势。在最佳條件下，DNA生物传感器的阻抗信号增加与目标DNA浓度的对数在1×10- 1 6～5×10- 1 0M范围内呈线性关系，检测限为3.3×10- 1 7M。此外，生物传感器对于DNA错配具有极好的选择性，且可以应用到转基因大豆样品的实际检测。

Moura-Melo等人设计了一个利用PCR扩增方法和序列特异性的电化学基因传感器用于CaMV的35S启动子中的特异性DNA序列的定量。Moura-Melo等使用通过硫醇化捕获探针和对氨基苯硫酚金表面的化学吸附构建的基因传感器，将未纯化的PCR扩增子与用荧光素标记的信号探针一起夹在传感层上。所提出的测试允许测定半合子（玉米MON810性状）和纯合（大豆GTS40-3-2）转化植物中的转基因拷贝数，并且对于两种GMO品系表现出至少0.25%的定量限。

Aghili等人设计了一种新型、敏感的电化学纳米生物传感器用于检测/定量转基因成分；在丝网印刷碳电极上修饰剥离型氧化石墨烯和金纳米海胆，并且还用特定的DNA探针以及苏木精作为电化学指示剂。所得传感器的线性范围为40.0～1100.0fM，检测极限为13.0fM。此外，生物传感器对非特异性序列的目标DNA具有良好的选择性，且成本低、时间效率高，可用于提取的转基因生物体DNA产品的实际样品环境。

4 展望

目前，转基因产品的检测仍旧面临着巨大的挑战，每年都会有新的GMO进入市场，对它们的检测和安全性评价至关重要。而随着生物技术和电子信息技术的发展，以及人们对于转基因的更深层次认识，转基因检测设备的便携化、智能化、与智能手机联用，以及多重检测都有很广阔的发展前景。