核桃楸皮提(萃)取物的抑菌性能研究

陈苛蒙，金黎明，包艳春，王晓彤，孙 怡，胡文忠(大连民族大学 生命科学学院 生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116605)

核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)为胡桃科胡桃属落叶乔木，根、皮、叶和种子都有一定的药用价值，其中对核桃楸皮(bark ofJuglansmandshuricaMaxim)的研究和应用最多。核桃楸皮是核桃楸的树皮，几乎无气味，味道略微苦涩，有清热解毒、止痢、明目的功能，可用于治疗细菌性痢疾、骨结核、麦粒肿等疾病[1-2]，民间偏方也有用其水煎剂治疗乳腺炎、肝炎、肿瘤等[3-4]。已知核桃楸皮中含有较多的活性物质，主要有胡桃醌、黄酮类、生物碱、二芳基庚酸类化合物、甙类化合物、鞣质类化合物、萘醌及其衍生物等[5-7]，在这些活性物质中，人们只对胡桃醌的研究较多，且一般集中在抗氧化、消炎、镇痛、抗肿瘤等方面[8-10]，而对核桃楸皮抑菌性能的研究较少。

本实验研究了核桃楸皮提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、弧菌、白色念珠菌5种致病菌的抑菌性能，对核桃楸皮活性成分的功能研究进一步补充了数据，也为开发抗菌药物奠定了一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料与试剂

核桃楸皮，辽宁丹东药业有限公司提供。清洗核桃楸皮并剪碎，于阴凉干燥处自然风干，置于橱柜中避光保存待用。

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等，国产优级纯试剂。

1.1.2 指示菌与培养基

指示菌：弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和白色念珠菌，实验室保藏菌。

LB培养基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL，pH约为7.0。

1.1.3 仪器与设备

BSA224S电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；DHG-9070A电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；MT-180B生化恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；KQ5200E超声波双频清洗机(宁波新枝生物科技股份有限公司)；HVE-50高压灭菌器(日本HIRAYAMA)；ZWY-A2102C双层可编程恒温摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)；G80F23CN1P-G5(S0)微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 核桃楸皮活性物质的提取

(1)核桃楸皮的乙醇提取。称取一定量核桃楸皮，应用超声波提取法提取核桃楸皮中的活性物质。工艺参数为：料液比1:8(g·mL-1)，乙醇体积分数95%，浸提温度35 ℃，作用时间30 min。收集提取液，提取容器中重新加入8倍量的溶剂进行提取，重复3次，将得到的抽提液合并进行减压抽滤，除去不溶性杂质，35 ℃下将滤液减压蒸馏，得到黑褐色膏状物。

称取一定量膏状物，用70%乙醇配制成3个浓度梯度，分别为50、5、0.5 mg·mL-1，并做好标记，保存待用。

(2)核桃楸皮的萃取。称取一定量的上述膏状物，加入适量去离子水，超声波振荡，使其形成分布均匀的悬浮液，依次使用适量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行萃取，每种有机溶剂各萃取3次。将各相萃取液用旋转蒸发仪40 ℃下真空浓缩，分别得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相及水相物质[11]。

用甲醇溶解各有机相物质，并配制成3个浓度梯度，分别为50、5、0.5 mg·mL-1，水相物质使用超纯水配制成相同的浓度，留存待用。

1.2.2 抑菌活性测定

采用琼脂平板打孔法测试核桃楸皮提取物的抑菌活性[12]。

LB培养基融化后，室温放置温度至40 ℃左右，接入供试菌种，倒平板，待培养基凝固后，用打孔器在平板内的培养基上打4个孔，分别注入3个浓度的核桃楸皮提取物溶液各200 μL，对照孔加入200 μL相对应的溶剂。

将培养皿放入培养箱内，37 ℃条件下培养12 h，观察抑菌圈的大小并测量抑菌圈的直径，做好记录。对所得结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 乙醇提取物的抑菌结果

乙醇提取物的抑菌效果如图1，其中标号1～3分别为50、5、0.5 mg·mL-1的乙醇提取物，标号4为70%乙醇的对照。乙醇提取物对5种致病菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，浓度为50 mg·mL-1时(若无提示以下均默认此浓度)抑菌圈直径为22.05 mm，对白色念珠菌的抑制效果最差，抑菌圈直径为10.50 mm。

(a)副溶血弧菌 (b)金黄色葡萄球菌 (c)大肠埃希氏菌 (d)鼠伤寒沙门氏菌 (e)白色念珠菌

2.2 萃取物抑菌结果

2.2.1 石油醚萃取物抑菌结果

石油醚萃取物经旋转蒸发后得到的浸膏有一部分不溶于甲醇，将这部分物质使用石油醚溶解后做抑菌实验，发现这些不溶于甲醇的物质对5种致病菌都无抑菌活性，故对实验结果无影响。其中溶于甲醇的物质只对金黄色葡萄球菌和弧菌有抑制作用，且对弧菌的抑制效果较好，抑菌圈直径达到22.69 mm，如图2(1～3分别为50、5、0.5 mg·mL-1的石油醚萃取物，4为甲醇对照)。

(a)副溶血弧菌 (b)金黄色葡萄球菌 (c)大肠埃希氏菌 (d)鼠伤寒沙门氏菌 (e)白色念珠菌

2.2.2 氯仿萃取物抑菌结果

氯仿萃取物的抑菌效果如图3(1～3分别为50、5、0.5 mg·mL-1的氯仿萃取物，4为甲醇对照)。氯仿萃取物对金黄色葡萄球菌、弧菌和白色念珠菌有抑制作用，对金黄色葡萄球菌抑制作用最好，抑菌圈直径为27.34 mm，对白色念珠菌的抑菌圈直径为14.30 mm。

(a)副溶血弧菌 (b)金黄色葡萄球菌 (c)大肠埃希氏菌 (d)鼠伤寒沙门氏菌 (e)白色念珠菌

2.2.3 乙酸乙酯萃取物抑菌结果

乙酸乙酯萃取物对5种致病菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最好，抑菌圈直径为26.25 mm，如图4(1～3分别为50、5、0.5 mg·mL-1的乙酸乙酯萃取物，4为甲醇对照)。

(a)副溶血弧菌 (b)金黄色葡萄球菌 (c)大肠埃希氏菌 (d)鼠伤寒沙门氏菌 (e)白色念珠菌

2.2.4 水相物质抑菌结果

剩余的水相中物质只对金黄色葡萄球菌有抑制效果，对其他4种致病菌无抑菌活性，实验结果如图5(1～3分别为50、5、0.5 mg·mL-1的水相物质，4为超纯水对照)。

(a)副溶血弧菌 (b)金黄色葡萄球菌 (c)大肠埃希氏菌 (d)鼠伤寒沙门氏菌 (e)白色念珠菌

2.3 分析与讨论

萃取物质对致病菌抑制作用的标准按照中国药品生物制品鉴定所、卫生部抗菌药物细菌耐药性检测中心制定的《抗菌药物药敏试验判断标准》进行判定，即抑菌圈20 mm以上为极度敏感，15～20 mm为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，10 mm以下为低度敏感。实验结果汇总见表1。

表1 实验结果汇总

注：打孔器直径9 mm

乙醇提取物对5种致病菌都有抑制作用，且对副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最好(5 mg·mL-1的浓度即对其有抑菌作用)。浓度为50 mg·mL-1时对金黄色葡萄菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌为极度敏感，对副溶血弧菌为高度敏感，对白色念珠菌为中度敏感，此结果为后续分离萃取提供了实验基础。

对于同一液相萃取物，石油醚相物质的最大浓度50 mg·mL-1对弧菌为极度敏感，对金黄色葡萄球菌为高度敏感，对其他3种致病菌均无影响；氯仿相物质的最大浓度对弧菌和金黄色葡萄球菌极度敏感，另外其对真菌中度敏感；乙酸乙酯相对5种致病菌都有抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌极度敏感；剩余的水相中含有的活性物质极少，只对金黄色葡萄球菌极度敏感。

对于不同萃取相来说，对弧菌和金黄色葡萄球菌抑制效果最好的是氯仿相，但是萃取活性物质种类最多的是乙酸乙酯相。

袁海舰[11]对核桃楸皮中的活性物质进行了提取与分析，结果表明，核桃楸皮的乙醇提取物、氯仿相和乙酸乙酯相是核桃楸皮中抑菌活性成分的富集组分，与本实验的结果较为一致。

3 结 论

本研究对核桃楸皮活性成分功能的进一步分析补充了数据，也为开发抗菌药物奠定了一定的基础。核桃楸皮经乙醇提取后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，采用琼脂扩散法测试其对5种致病菌的抑菌活性。结果表明，乙醇和乙酸乙酯萃取物对5种致病菌都有抑制作用；石油醚萃取物只对弧菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，50 mg·mL-1浓度下的抑菌圈直径分别为22.69 mm和16.58 mm；氯仿萃取物对弧菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有抑制作用，50 mg·mL-1浓度下的抑菌圈直径分别为25.01 mm和27.34 mm。具体不同萃取相中的活性物质成分有待于进一步的探索。

参考文献：

[1] KYUNG S L, GAO L, SUNG H K, et al. Cytotoxic diarylhetanoids form the roots ofjuglansmandshurica[J]. Nat Prod, 2002, 65: 1707-1708.

[2] 于海玲. 核桃楸的研究进展[J]. 延边大学学报, 2005, 28(2): 154-156.

[3] 宋玉荣,姜春霞. 满药复方木鸡颗粒研究新进展[J].中国医药导报,2013, 10(1): 4-5.

[4] 钟美玲,刘宝全,鲁晓莉,等.煎煮方式对满药木鸡汤药对溶出组分的影响[J].时珍国医国药,2017,28(10):2396-2400.

[5] 赵玉佳,雷涛,张春军,等.核桃楸皮化学成分研究进展[J].牡丹江医学院学报,2010,31(4):61-63.

[6] 梁慧峰. 核桃楸的化学成分及利用研究进展[J].北方园艺, 2010(16): 219-221.

[7] 王莲萍, 张莲珠, 吕雪峰,等. 胡桃楸树皮的研究进展[J]. 西北药学杂志, 2010, 25(3): 231-232.

[8] 梁启超,刘爽,张朝立．核桃楸皮提取物对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用及对细胞周期的影响[J]．林产化学与工业,2017,37(3) :136-140．

[9] 雷涛,梁启超,常乐,等.核桃楸皮乙醇提取液对人肝癌细胞抑制作用的研究[J].实验室科学,2012,15(6):81-82.

[10] 吴铁松，何文平，吴丽霞. 核桃楸树皮水提取物抗突变和抑瘤作用研究[J]. 国际医药卫生导报,2011, 17(12): 1412.

[11] 袁海舰. 核桃楸树皮中活性物质的提取与分析[D]. 哈尔滨:东北林业大学, 2007.

[12] 谭才邓,朱美娟,杜淑霞,等.抑菌试验中抑菌圈法的比较研究[J].食品工业，2016,37(11):122-125.