凡纳滨对虾对哈维氏弧菌不同攻毒方式的响应

樊 英, 许 拉, 王晓璐, 李 乐, 盖春蕾, 于晓清, 李天保, 叶海斌

(山东省海洋生物研究院, 山东省海水养殖病害防治重点实验室,山东 青岛 266104)

哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)隶属于弧菌科弧菌属，是海水中一种常见的病原菌，在海洋环境中分布很广，主要感染虾及鱼类[1-2].通常情况下，哈维氏弧菌是凡纳滨对虾(Litopenaeusvanname)的正常菌群;在养殖动物自身健康或养殖环境发生变化的情况下，该菌开始大量繁殖，通过不同方式不同程度地打破宿主微生态平衡，损伤宿主的组织结构.对虾被感染后一般会出现肝胰腺混沌、白鳃、红腿、肌肉白浊等症状[3].目前发现哈维氏弧菌的致病性相关因子主要为胞外产物(extracellular products, ECP)，包括蛋白酶、溶血素、外毒素、脂多糖等，还与噬菌体介导的毒力基因转移相关[4-7].弧菌的致病过程与对虾生理状态、环境胁迫、菌的攻毒方式等相关.注射和浸浴是病原学研究中常见的攻毒手段.本文研究凡纳滨对虾在不同浓度和不同感染途径的哈维氏弧菌作用下，肠道组织形态、肠道弧菌数量及虾体死亡率的变化，为阐明哈维氏弧菌的致病机理提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 攻毒对象及养殖条件

健康的凡纳滨对虾来自山东滨州某养殖场，体长约3.5 cm.正式试验前，凡纳滨对虾暂养于塑料桶(85 cm×55 cm×45 cm)内4 d，连续充气，以配合饲料饱食投喂.养殖水体盐度为18‰，水温26 ℃，pH 8.0，亚硝酸盐含量0.01 mg·L-1，氨氮含量0.01 mg·L-1.随后将凡纳滨对虾随机分组，每组20尾.在攻毒试验前禁食1 d.

1.2 供试菌株及致病性

试验所用攻毒菌株是从某养殖场濒死对虾肝胰腺分离的哈维氏弧菌，由山东省海水养殖病害防治重点实验室分离、保存(命名TCBS-G).通过预试验确定哈维氏弧菌的半致死浓度LD50(7 d)为1.3×107CFU·mL-1.

将分离纯化的哈维氏弧菌接种于2216e液体培养基，28 ℃培养20 h，通过分光光度计560 nm(D560 nm)比浊测定后备用.将供试菌液(1.8×107CFU·mL-1)300 mL加入20 L水体中，浸泡20尾试验对虾，对照组为同体积无菌生理盐水.浸泡12 h后捞出试验对虾，彻底换水，健康养殖条件下暂养4 d，每天观察对虾被感染后的发病与死亡情况，以濒死对虾重新分离到原感染菌为致病性判定指标.

1.3 注射攻毒试验

根据预试验结果，设立对照组和不同浓度的哈维氏弧菌试验组，每组3个平行.将供试弧菌浓度通过无菌生理盐水稀释至105和107CFU·mL-1.采用1 mL无菌注射器将0.1 mL稀释哈维氏弧菌注射入凡纳滨对虾第五至第六腹节处，对照组注射同体积的无菌生理盐水.监测所有凡纳滨对虾在哈维氏弧菌感染后的生存情况，并记录死亡的时间，试验周期为7 d.

1.4 浸浴攻毒试验

根据预试验结果，共设立3个处理组.将活化的哈维氏弧菌供试菌液[105和107CFU·mL-1]300 mL加入20 L水体中，浸泡20尾试验凡纳滨对虾，同时设同体积无菌生理盐水作为对照，每组3个平行.隔离养殖于试验水箱中，浸泡过夜后捞出试验对虾，彻底换水，暂养，每天观察凡纳滨对虾感染后的发病与死亡情况，试验周期为7 d.

1.5 凡纳滨对虾肠道对哈维氏弧菌感染的响应

在供试菌株感染凡纳滨对虾12、24、48、72、96 h，分别从对照组和攻毒试验组中随机挑取濒死的凡纳滨对虾3尾，冰上解剖，获取肠道，-80 ℃无菌保存，备用.将肠道内容物稀释后置于TCBS选择性培养基上进行弧菌计数.将48 h中肠组织样品置于Bouin氏液中固定，放入不同浓度酒精进行梯度脱水后浸蜡、包埋，使用切片机(SHANDON, AS325)连续7 μm切片，干燥后利用苏木精—伊红(HE)染色法染色，最后观察并进行显微摄影(OLYMPUS, BX53F).

1.6 计算公式及统计方法

累积死亡率/%=Dt/D0×100(D0和Dt分别为攻毒过程中凡纳滨对虾初始数量和累计死亡数量).

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行单因素方差分析，若差异显著，则用Duncan′s检验法进行多重比较，显著性水平为P<0.05.

2 结果与分析

2.1 供试菌的致病性

凡纳滨对虾被供试哈维氏弧菌感染后出现死亡现象，而对照组在4 d观察期内均正常.发病虾体发白，肝胰腺出现混浊状态，有的呈现浅白色，提取肠胃样品肉眼观察，呈现空、透现象；被感染的濒死对虾经细菌学检验，分离到大量的感染菌，其形态及理化特性与原感染菌一致(表1).

2.2 注射方式对感染凡纳滨对虾的影响

图1显示，高浓度(107CFU·mL-1)试验组的对虾在第1天便出现死亡现象，第3天死亡率达到最大值，之后趋于稳定；低浓度(105CFU·mL-1)试验组对虾出现死亡的时间与高浓度试验组相近，但死亡数量相对较少，第4天达到最大值.

2.3 浸浴方式对感染凡纳滨对虾的影响

图2显示，高浓度(107CFU·mL-1)试验组对虾在第1天的死亡情况较低浓度(105CFU·mL-1)试验组严重，第2天死亡数量急剧增大，第3天死亡率达到最大值；低浓度试验组死亡情况相对平缓，第4天达到最大值.

表1 供试菌生化反应结果(陆桥生物有限公司试剂盒)1)Table 1 Biochemical reaction results of V.harveyi tested (Beijing Land Bridge Technology CO, LTD)

1)“+”表示阳性,“-”表示阴性.

图1 注射哈维氏弧菌7 d内凡纳滨对虾累积死亡率Fig.1 Accumulative mortality of L.vannamei injected V.harveyi in 7 days

2.4 肠道内容物弧菌数量对不同攻毒方式的响应

不同攻毒方式导致弧菌数量出现不同程度的增加.注射12 h肠道弧菌数量未见显著变化(P>0.05)，第3天达到最多，与对照组差异显著(P<0.05)；而浸浴第1天肠道弧菌数量即大量增加，与对照组差异显著(P<0.05)，第2天达到最大值，随后弧菌数量发生回落(表2).

表2 攻毒方式对凡纳滨对虾肠道内容物弧菌数量的影响1)Table 2 Effect of infection methods on Vibrio number in the gut of L.vannamei

1)数据为平均值±标准误.同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05).

2.5 肠道组织结构对不同攻毒方式的响应

由图3可见，在不同攻毒方式和不用浓度哈维氏弧菌作用下，对虾肠道组织可分为轻度感染和重度感染.轻度感染主要发生于低浓度注射试验组，其症状为肠道上皮细胞边缘略变薄(图3B).重度感染主要发生于高浓度试验组，且浸浴感染较严重，症状主要为上皮细胞损伤、变形并脱落，细胞核裂解，严重者肠黏膜褶皱处向下沉落或脱落，肠壁上环肌肉与纵肌层也有脱落(图3F)；高浓度注射试验组表现为细胞核模糊不清，少许出现上皮细胞与固有层分离现象(图3C).

A.注射对照组;B.105 CFU·mL-1注射试验组;C.107 CFU·mL-1注射试验组;D.浸浴对照组;E.105 CFU·mL-1浸浴试验组;F.107 CFU·mL-1浸浴试验组.图3 不同攻毒方式下凡纳滨对虾肠道组织结构的变化Fig.3 Change of gut histological structure of L.vannamei infected by different methods

3 讨论

对虾被致病菌感染后，在血淋巴、肌肉及肝胰腺内细胞和体液免疫应答等多方面呈现对外界致病菌的防御，但是针对不同攻毒方式下弧菌与对虾肠道相互作用的研究极为缺乏.Rajendran et al[8]针对甲壳类生物开展了哈维氏弧菌浸浴攻毒试验，观察发现浸浴侵染后的动物组织形态变化与自然侵染相似，说明浸浴攻毒是一种最为自然并且行之有效的侵染生物体的方式[9-10].然而，不同攻毒方式造成的损伤不同，涉及不同的致病机理.注射攻毒是将病菌经对虾腹节处注射到肌肉内，经过自身系统循环，分散至全身，到达肠道需要一定的时间和过程；浸浴攻毒是致病菌经对虾口或鳃被摄入体内，之后到达肠道，进而伤及全身其他部位和功能.因此，浸浴攻毒比注射攻毒更容易损伤虾体的肠道组织.本研究中，浸浴攻毒后对虾出现死亡的时间比注射攻毒早且状况严重.

甲壳动物被哈维氏弧菌感染后会出现许多疾病[9-10].Diggles et al[10]研究表明，绿岩龙虾(Jasusverreauxi)被哈维氏弧菌感染后出现蚕食现象，外表皮受伤更便于哈维氏弧菌的寄居繁殖，加重病害程度和发生范围.Jayasree et al[11]发现，斑节对虾(Penaeusmonodon)在被哈维氏弧菌感染后出现附肢发红、外表皮松软及白便等症状，这与本研究中凡纳滨对虾被哈维氏弧菌感染后表现的症状相似.

对虾肠道黏膜褶皱的高低和疏密、上皮细胞的完整性和数量等会影响肠道性能[9,12].正常肠上皮细胞排列紧密，细胞间隙清晰，内壁为高柱状上皮组织，肠内壁向肠腔凸起形成褶皱[13].对虾被致病菌感染后，其上皮组织损伤开始于上皮细胞，细胞质明显变薄，随着侵染的加深，肠道上皮细胞核肥大，核边缘模糊不清，上皮细胞核最终完全降解形成胞内空洞[14].本研究发现，在不同方式、不同浓度弧菌攻毒后对虾肠道的组织结构表现为轻度感染和重度感染.随着弧菌浓度的提高和攻毒时间的延长，中肠组织损伤情况逐渐加重.重度感染表现为上皮细胞完全溃散并脱落，肌层也被损伤.此外，对虾肠道在受到哈维氏弧菌侵染后，黏膜褶皱处发生皱缩或损伤直至脱落.然而，有关对虾的肠道修复机制需进一步深入研究.

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