检测莠去津残留试剂盒的研制

◎ 扶 胜，罗维超，袁学伟，周 艳，邓小霞

（贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州 贵阳 550009）

莠去津是目前世界上使用范围最广、使用量最大的选择性内吸前导型苗前、苗后除草剂，主要用于玉米和高粱等粮食作物以及果园和林地等的除草[1]。莠去津具有毒性，易通过食物进入人体，对人体的神经系统、免疫系统、生殖系统具有毒性以及遗传毒性[2]，目前被列为国际环境优先控制污染物[3-4]。而在农产品的进出口贸易、食品和环境安全的监督检测中出现的检测技术性空缺，严重影响了我国农产品的出口[5]。因此，研发一种适合于大批量农产品的现场快速检测的产品具有及其重要的意义。

目前，莠去津残留的检测方法有气相色谱法（GC）[6]、气相色谱-质谱串联用法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）和分子印迹技术等，这些技术方法检测灵敏度高、特异性强，但是比较耗时，过程较为繁琐，主要是样品前处理步骤需要大量的时间，同时仪器检测方法所需的大型仪器和设备耗资巨大，对实验操作人员的专业程度要求较高，无法实现现场大规模样品的快速检测。

与之相比，酶联免疫方法也具有特异性好、灵敏度高的特点，同时酶联免疫分析方法还具有操作简便、检测成本低、检测用时较短、对实验人员的专业程度无特殊要求等特点，适合于批量样品的筛选检测，普通人员只需稍微培训即可上手进行操作检测，能够满足各阶层人员以及企业或相关部门对食品安全快速检测。目前，在ELISA分析领域有不少的报道，王彩虹等通过合成人工抗原并制备出单克隆抗体的研究该方法建立的间接ELISA检测莠去津的方法，最低检测限量达到了ng级，奠定了食品中莠去津残留检测的基础；生威等建立了一种快速检测玉米中莠去津残留的酶联免疫分析方法；Barchanska等应用酶联免疫方法对奶中莠去津残留进行了监测。目前，尚未有关于该方法应用于莠去津在甜料甘蔗中残留的检测相关报道，因此，本研究相关的成果可为莠去津在食品中的残留快速检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雌性Balb/c小鼠（6～8周龄），北京勤邦生物技术有限公司；莠去津标准品（纯度≥99%）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、氢氧化钠、三聚氯氰，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-氨基丁酸，上海麦克林生化科技有限公司；异丙胺，百灵威科技有限公司产品。

1.2 仪器与设备

匀质机，上海茸研仪器有限公司；电子天平，永康市龙蓓工贸有限公司；XH-C漩涡混合器，金坛区金城海澜仪器制造厂；TDL-5000-CR低速离心机，上海圣科仪器设备有限公司；微量移液器（单道20～200 µL、100～1 000 µL，多道20～300 µL），上海力辰仪器科技有限公司；SPX-250生化培养箱，上海合呈仪器制造有限公司；酶标仪，北京线上生物科技有限公司；磁力搅拌器，巩义予华仪器有限公司；温度计、四口瓶、恒压滴液漏斗、抽滤瓶、抽滤漏斗，上海禾汽玻璃仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莠去津半抗原的合成

合成路线如图1所示。在四口瓶中加入水、异丙胺，插入温度计，冰水浴冷却反应混合物至0～5 ℃，缓慢滴加三聚氯氰，当三聚氯氰剩下一半时开始滴加30%的氢氧化钠水溶液，滴加的速度和滴加三聚氯氰的速度保持一致，直到所有原料全部滴加完成，保持0～5 ℃反应40 min，反应中，在另一个四口瓶中加入4-氨基丁酸和水，控制该溶液温度在20～25 ℃，开始滴加反应完全的异丙胺和三聚氯氰的反应液，当加入一半时，开始滴加30%氢氧化钠水溶液，滴加的速度和反应液滴加的速度保持一致，直到所有原料全部滴加完毕。保持温度反应40 min。反应瓶底部产生大量白色固体，过滤该固体，洗涤至中性，空气中干燥后，加入100 mL的正己烷中，搅拌过夜，次日进行过滤，用正己烷冲洗滤饼3次，每次20 mL，得到的固体再空气中干燥后即为目标产物。各原料和三聚氯氰的摩尔比均为1∶1。

图1 莠去津半抗原的合成路线图

1.3.2 人工抗原的制备

（1）免疫的原制备。将45 mg莠去津半抗原溶于1 mL DMF中，加入70 mg NHS和70 mg EDC，室温反应30 min后，缓慢滴加4 mL BSA的PB溶液，滴毕，室温搅拌过夜。次日将反应液离心，收集上清液。随后用0.02 mol/L PB缓冲液将偶联所得免疫原透析3天，每天早晚更换透析液，以除去未反应的小分子物质。即得莠去津免疫原，分装，于-20 ℃保存备用。

（2）莠去津包被原制备。称取45 mg莠去津半抗原溶解于1 mL DMF溶液中，分别加入100 mg EDC和100 mg NHS活化，30 min后将其加入到150 mg载体蛋白OVA（溶于5 mL PB缓冲液中）室温搅拌过夜。次日将反应液离心，取上清液，4℃的条件下，用0.02 mol/L PB缓冲液透析3天，每天更换透析液两次后分装，-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3 莠去津单克隆抗体制备

按照文献的方法制备腹水单克隆抗体，每只小鼠的免疫剂量为200 µg。抗体的纯化采用饱和硫酸铵法。

1.3.4 抗原抗体最佳工作浓度的确定

将莠去津的包被抗原和单克隆抗体溶液进行倍比稀释，进行间接竞争ELISA方阵试验，分别选取OD450最接近1.0的浓度作为最佳工作浓度。

1.3.5 间接竞争ELISA方法的建立

用相应的抗原缓冲液将包被抗原稀释成10 µg/mL，100 µL/孔包被在96孔酶标板上，37 ℃避光孵育2 h；在4 ℃冰箱中保存过夜，次日弃去孔中包被液，用洗涤液洗涤1次，拍干，150 µL/孔加入封闭液，37℃保存2 h；直接拍干，加入一系列浓度呈现梯度的莠去津高标溶液，50 µL/孔，加毕，加入经抗体稀释液稀释成最佳工作浓度的抗体溶液，50 µL/孔，然后25 ℃避光反应30 min；洗涤4～5次后，拍干，加入酶标二抗，100 µL/孔，25 ℃避光反应30 min后用洗涤液洗涤4～5次，拍干，先加入底物液A液（过氧化脲）再加入B液（四甲基联苯胺），各50 µL/孔，25 ℃保存15 min后加入2 mol/L H2SO4水溶液，孔内液体由蓝色变成黄色，将酶标仪设定波长为450 nm，测定每孔吸光度值（OD值）。并用RIDASCREEN软件进行数据处理。

1.3.6 标准曲线的绘制

采用间接竞争ELISA方法建立标准曲线，分别选择标准品浓度0、3、9、27、81 ng/mL和243 ng/mL，以浓度为0 ng/mL时的OD值为B0值，相应莠去津浓度的OD值为B值，以百分吸光度值（B/B0）为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，采用RIDASCREEN软件绘制标准曲线并打印成纸质文档进行实验结果的观察。

1.3.7 甘蔗和玉米的样本前处理

用10 mL的离心管称取匀质后的玉米和甘蔗样品，玉米和甘蔗分别称取两管，每一管中样品的质量为1 g，然后将其中一管玉米样品和一管甘蔗样品进行加标，加标量为10 µg，然后每一管中加入2 mL甲醇，用涡旋仪涡动1 min将样品混匀；室温4 500 r/min离心5 min后取上清液200µL，加入到含有800 µL复溶液的样品管中混匀进行用于ELISA分析。确定甲醇作为提取剂的提取效果。

1.3.8 确立试剂盒各项技术参数

（1）试剂盒检测限确立试验。用20个空白样本通过试剂盒测定的光密度在标准曲线上对应的莠去津浓度的平均值（X）和标准差（S）来表示为MDL=X+3S。

（2）试剂盒准确度和精密度确立试验。分别用5、10、15µg/kg三个不同浓度的莠去津标准品作空白玉米和甘蔗样本的添加回收试验，计算其回收率和变异系数，分别表示如下：

式中，Cx为添加了一定莠去津含量的样本经过标准曲线分析得到的实际浓度，µg/kg；C0为空白样本经过标准曲线分析得到的实际浓度，µg/kg；C为实际添加的莠去津浓度，µg/kg。

（3）试剂盒稳定性试验。将一定量的试剂盒保存于4℃环境中，每隔1个月取出适量，分别测定其空白标准品的OD值、IC50，及按上述方法进行添加回收试验所测得的回收率以及变异系数，根据试验结果判断试剂盒的稳定性；考虑到试剂盒在运输和使用过程中可能会有非正常保存条件出现，将试剂盒保存在37 ℃条件下，每隔1天取出进行测定，直到试剂盒的灵敏度和回收率开始下降为止停止检测。一般情况下，在37℃稳定1天，相当于4～10 ℃保存45天。由此确定其保质期。

（4）可靠性试验。各随机抽取玉米和甘蔗样品20份，用本试剂盒方法与国家标准中标准方法中气相色谱法（对水果、蔬菜、谷物中莠去津的最低检测浓度为4 µg/kg）分别对其进行测定，根据两种检测方法的实验结果进行比较，验证试剂盒检测实际样本的准确度。

2 结果与分析

2.1 最佳工作浓度的选择

运用方阵法测定不同包被原和单克隆抗体的间接竞争抑制ELISA测定结果（OD450值），见表1。在ELISA包被过程中，包被效果与浓度呈正相关，但浓度过高，会降低待测物的竞争能力，从而降低曲线灵敏度。因为酶标仪测定OD450值的敏感范围在1.00左右，为了保证测定结果的灵敏可靠，根据表中的结果，确定实验的最适包被原稀释倍数为13.5×104，最佳抗体稀释倍数为1∶125 000。

表1 不同包被原和单克隆抗体稀释浓度的OD450值表

2.2 标准曲线的建立

根据建立的间接竞争ELISA方法，将莠去津标准品浓度稀释为0、3、9、27、81 ng/mL和243 ng/mL，用上文所确定的抗体稀释倍数稀释抗体，用酶标仪进行检测，其中0和3 ng/mL点双孔，其余的浓度点单孔，采用二步法进行检测，得出相关系数 R2=0.9955，IC50为18 µg/L。标准曲线如图2所示。

图2 莠去津的检测标准曲线图

2.3 试剂盒各项技术参数的确定

2.3.1 试剂盒检测限试验

由表2可知，该试剂盒方法对玉米和甘蔗样本的检测下限分别为 24.60 µg/kg、26.30 µg/kg。

表2 莠去津试剂盒方法检测限表

2.3.2 准确度和精密度试验

分别以回收率和变异系数表示试剂盒测定的准确度以及检测精密度。分别设置空白玉米和甘蔗样本，以50、100、150µg/kg 3个添加浓度做添加回收实验，每个浓度做4个平行，用3个批次的试剂盒进行测定，分别计算回收率和批内、批间变异系数，结果见表3。

表3 莠去津试剂盒的准确度和精密度表

由表3可知，以3个不同浓度的莠去津标准品对空白玉米和甘蔗样本进行添加时，其加标回收率范围为88.5%～106.4%，批内变异系数范围为5.0%～7.3%，批间变异系数范围为6.9%～8.8%，均小于10%，以上结果说明，该试剂盒的各项参数均符合要求。

2.3.3 稳定性试验

试剂盒在2～8 ℃的保存条件下，经过12个月的测定，其最大吸光度值（零标准）、抑制中浓度、莠去津添加回收实验测定值均在正常范围之内。在各种非正常保存条件中，测定结果也没有异常。从以上可知试剂盒可以在2～8 ℃至少保存12个月以上。

2.3.4 可靠性试验

通过ELISA试剂盒法和气相色谱法对随机抽取的玉米、甘蔗样本进行测定。玉米和甘蔗样本的阳性判定线为27 µg/kg，结果筛选出1份阳性玉米样本和3份阳性甘蔗样本，两种方法的比较结果见表4。

表4 ELISA法和GC法检测结果比较表

由表4可知，用ELISA法和GC法的测定结果基本一致，适用于玉米和甘蔗中莠去津残留的筛选。

3 结论

本研究通过全合成法制备出莠去津小分子半抗原，该半抗原与载体蛋白偶联合成的人工抗原经动物免疫获得单克隆抗体。经筛选纯化后，初步建立了莠去津酶联免疫试剂盒检测方法。该方法的灵敏度为3 µg/L，对玉米和甘蔗样本的最低检测限为27 µg/kg，样本添加回收率范围为88.5%～106.4%，批间/批内变异系数为均低于10%。本研究所得结果在其检测限范围内，因此可用于相关行业的莠去津残留快速检测。此外，本实验所研制的试剂盒的使用可最大限度地节约时间成本和经济成本，对检测人员的要求较低，适用于大量样本中莠去津残留量检测的快速筛选，可更好地应用于我国基层检测单位、政府职能监管部门等开展的检测工作，是一种可靠的莠去津农药残留的快速检测方法。

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