泽泻总三萜超声辅助提取工艺优化

石 峰SHI Feng 陈 雨 张亚琴 - 马留辉 - 窦明明 - 杨正明 - 陈兴福 -

(1. 四川农业大学农学院，四川 成都 611130；2. 农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室，四川 成都 611130)

药材泽泻为泽泻科植物泽泻[Alismaorientalis(Sam.) Juzep.]的块茎[1]，又名水泻、芒芋、泽芝、及泻、如意菜等[2]，在中国福建、四川等地大规模种植，素有“建泽泻”“川泽泻”之称，具有较高的营养价值和药用价值。2002年3月中国卫生部明确，泽泻可用作保健食品原料。现代研究[3]表明，泽泻化学成分主要以萜类为主，含有三萜、二萜、倍半萜、多糖等成分，其中三萜类化合物具有抗血栓、降血脂、降血糖、降低血黏度、抗动脉粥样硬化、延缓衰老、利尿、解痉、保肝、抗炎、免疫调节等功效。

目前关于植物总三萜的研究较多，主要有热回流法、超声辅助提取和超临界二氧化碳萃取[4-6]等。其中热回流提取虽然提取率较高，但时间长、能耗高；超临界二氧化碳萃取操作复杂，且安全性低；而超声提取既节能效率又高，是很多活性物质提取的新技术[7]。邓迎娜等[5]采用超声提取泽泻总三萜，且优于传统乙醇回流提取，最大提取率不足2%。本研究在此基础上增加温浸辅助提取，采用超声、温浸辅助提取泽泻中总三萜，在单因素试验基础上，以泽泻总三萜提取率为评价指标，利用响应面法进行优化，为深入开发和有效利用泽泻中总三萜类活性成分提供相应的科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

超声波清洗仪：SB 25-12 DTDN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

电热鼓风干燥箱：101-3 AB型，天津市泰斯特仪器有限公司；

电子恒温水浴锅：DZKW-4型，北京中兴伟业仪器有限公司；

酶标仪：Multiskan FC型，上海辅泽商贸有限公司；

精密电子天平：JD 300-3千分之一型，沈阳龙腾电子有限公司；

高速万能粉碎机：QE-100克型，浙江屹立工贸有限公司。

1.2 材料与试剂

泽泻：采自四川省眉山市彭山区谢家镇红石村，经四川农业大学陈兴福教授鉴定为泽泻科植物泽泻[Alismaorientalis(Sam.) Juzep.]的块茎，经干燥、粉碎并过60目筛，备用；

23-乙酰泽泻醇B对照品：批号PS15031701，纯度≥98%，成都普思生物科技股份有限公司；

无水乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸等：分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 泽泻总三萜的提取 准确称取泽泻干燥块茎粉末1.0 g，按照试验方案加入一定量的一定体积分数乙醇，在一定温度下浸提一定时间，并超声提取一定时间，过滤，取滤液稀释一定浓度于试管中，作为待测液。

1.3.2 泽泻总三萜含量与提取率的测定

(1) 对照品溶液的制备：精密称取23-乙酰泽泻醇B对照品1.26 mg，于25 mL容量瓶中，加乙醇适量溶解，摇匀，定容，得到浓度为0.050 4 mg/mL的23-乙酰泽泻醇B对照品溶液，待用。

(2) 样品溶液的制备：精密量取1.3.1项下待测液0.2 mL，用相应体积分数的乙醇稀释至1 mL，摇匀，即得样品溶液。

(3) 测定波长的确定：分别取对照品溶液和样品溶液，按照1.3.2(4)项下显色方法显色，于400～600 nm波长之间扫描，结果表明，两者均在555 nm波长处有最大吸收，故选择555 nm为检测波长。

(4) 标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL于10 mL的试管中，在60 ℃水中把溶剂挥干，挥干后于试管中加入0.2 mL 的5%香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，60 ℃水浴15 min，冷却5 min，加冰醋酸5.0 mL，摇匀，测定波长为555 nm[8]。横坐标为23-乙酰泽泻醇B含量，纵坐标为吸光度，得到标准曲线：Y=8.496X+0.000 1，相关系数R2=0.999 4，表明吸光度与质量线性关系良好。

(5) 样品含量测定：取1.3.2(2)项下样品溶液0.2 mL，按照1.3.2(4)项下方法显色，在555 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线的回归方程计算，得样品总三萜含量，按式(1)计算提取率。

(1)

式中：

c——总三萜提取率，%；

m1——总三萜含量，g；

m2——泽泻原料重，g。

1.3.3 单因素试验

(1) 乙醇体积分数对泽泻总三萜提取率的影响：准确称取泽泻干燥块茎粉末1.0 g于50 mL离心管中，分别加入40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇16 mL，置50 ℃恒温水浴锅浸提45 min，超声30 min，测定总三萜含量，3次平行试验取平均值，计算总三萜提取率。

(2) 料液比对泽泻总三萜提取率的影响：准确称取泽泻干燥块茎粉末1.0 g于50 mL离心管中，分别加入80%乙醇8，10，12，14，16 mL，置50 ℃恒温水浴锅中浸提45 min，超声30 min，测定总三萜含量，3次平行试验取平均值，计算总三萜提取率。

(3) 超声时间对泽泻总三萜提取率的影响：准确称取泽泻干燥块茎粉末1.0 g于50 mL离心管中，加入80%乙醇12 mL，置50 ℃恒温水浴锅浸提45 min，超声10，20，30，40，50 min，测定总三萜含量，3次平行试验取平均值，计算总三萜提取率。

(4) 浸提时间对泽泻总三萜提取率的影响：准确称取泽泻干燥块茎粉末1.0 g于50 mL离心管中，加入80%乙醇12 mL，置50 ℃恒温水浴锅浸提15，25，35，45，55 min，超声30 min，测定总三萜含量，3次平行试验取平均值，计算总三萜提取率。

(5) 浸提温度对泽泻总三萜提取率的影响：准确称取泽泻干燥块茎粉末1.0 g于50 mL离心管，加入80%乙醇12 mL，分别在30，40，50，60，70 ℃恒温水浴锅中，浸提45 min，超声30 min，测定总三萜含量，3次平行试验取平均值，计算总三萜提取率。

1.3.4 响应面试验设计 根据单因素试验结果，采用浸提时间、乙醇体积分数、浸提温度和料液比为试验因素，建立四因素三水平的Box-Behnken响应面试验设计，以总三萜提取率为响应值。

1.4 数据处理

运用Excel和Design-Expert 8.0.7.1 软件程序，利用响应面分析法对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对总三萜提取率的影响 由图1可知，在乙醇体积分数80%以内，泽泻总三萜的提取率逐渐增加；当乙醇体积分数为80%时，总三萜提取率有峰值。乙醇体积分数超过80%，随着乙醇体积分数进一步增加，总三萜提取率反而降低，可能是三萜类化合物是弱极性物质，随着乙醇体积分数的继续增加，溶剂极性越弱，导致三萜类化合物的溶解度降低，总三萜提取率下降[5]。因此，确定最佳的乙醇体积分数为80%。

2.1.2 料液比对总三萜提取率的影响 由图2可知，随着溶剂用量的增加，总三萜的提取率也逐渐增加。当料液比达到1∶12 (g/mL)以后，提取率呈现微弱的下降趋势，可能是总三萜含量在1∶12 (g/mL)左右达到峰值，随着溶剂量的继续增大，反而起到稀释的效果。为节约成本，综合考虑选择1∶12 (g/mL)为适宜的料液比。

图2 料液比对泽泻总三萜提取率的影响Figure 2 Effect of solid-liquid ratio on yield of the total triterpenoid

2.1.3 超声时间对总三萜提取率的影响 由图3可知，总三萜的提取率随着超声时间的延长而增大，30 min后提取率反而缓慢下降，可能是三萜类化合物的结构稳定性对超声比较敏感，长时间在较强的机械剪切、振动作用下，其结构可能会发生改变[9]，从而降低提取率。因此，综合考虑能源消耗和生产效率，选择超声提取时间为30 min。

图3 超声时间对泽泻总三萜提取率的影响Figure 3 Effect of ultrasonic time on yield of the total triterpenoid

2.1.4 浸提时间对总三萜提取率的影响 由图4可知，样品在溶剂中浸提，随着时间的延长，提取率呈上升趋势。当时间为45 min时，提取率出现峰值，随着浸提时间的延长，提取率反而下降，可能是在一定温度下，三萜类化合物长时间在提取剂中其结构稳定性减弱。因此，选择45 min 为较适宜的浸提时间。

2.1.5 浸提温度对总三萜提取率的影响 由图5可知，浸提温度在60 ℃以内时，提取率随之增加。在60 ℃时，提取率出现峰值，温度继续升高，提取率反而下降。可能是三萜类化合物对温度比较敏感，当温度升高到一定程度以后，长时间受热导致其结构变化或降解，导致提取率下降[10-11]。因此，选取60 ℃为最佳浸提温度。

图4 浸提时间对泽泻总三萜提取率的影响Figure 4 Effect of extraction time on yield of the total triterpenoid

图5 浸提温度对泽泻总三萜提取率的影响Figure 5 Effect of extraction temperature on yield of the total triterpenoid

2.2 响应面法优化提取工艺

在单因素试验基础上，应用四因素三水平的中心组合试验设计，以4个因素作为自变量，总三萜提取率为因变量，优选泽泻总三萜的提取条件。试验因素水平见表1。试验设计与结果见表2。

2.3 响应面工艺优化分析

将所得数据采用Design-Expert 8.0.7.1 软件来统计分析，得到总三萜提取率与提取条件的回归方程为：

R=3.06-0.097×A-0.040×B+0.083×C-0.015×D-0.11×AB+0.12×AC+0.096×AD+0.027×BC+3.972E-003×BD+0.14×CD-0.080×A2-0.28×B2-0.10×C2-0.39×D2。

(2)

由表3可知，选用模型P<0.000 1，F=38.62，说明具有统计学意义，该二次回归方程模型极显著。失拟项不显著(P=0.451 9>0.05)，模型R2为0.974 8，adj-R2为0.949 5，表明回归方程拟合度良好，可以用来优化和预测总三萜最佳提取工艺条件。根据回归系数的显著性检验可知，一次项A、B、C均对总三萜提取率的影响达到显著效应，交互项AB、AC、AD、CD对提取率的交互影响显著，二次项A2、B2、C2、D2对提取率的影响达到显著效应。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and coded levels in the central composite design

由图6(a)可知，在浸提温度和料液比一定条件下，随着乙醇体积分数的升高，响应值呈缓慢下降趋势，随着浸提时间的增加，响应值先升高后下降，当乙醇体积分数约至70%、浸提时间约至45 min，响应值存在极大值。由图6(b)可知，在浸提时间、料液比一定条件下，乙醇体积分数响应曲面较陡峭，说明2个提取条件对总三萜的提取率有较显著的交互影响，当乙醇浓度约为70%、浸提温度约至60 ℃，响应值达最大。由图6(c)可知，在浸提时间和浸提温度一定条件下，随着料液比的增加，响应值先升高后降低，当乙醇体积分数约为70%、料液比约至1∶14 (g/mL)，响应值最大。由图6(d)可知，在乙醇体积分数、浸提时间一定条件下，料液比响应曲面较陡峭，说明料液比与浸提温度对提取率具有较显著交互影响，当料液比约至1∶14 (g/mL)、浸提温度约至60 ℃，响应值最大。综上可得，该模型有稳定点，且稳定点是最大值。

表2 试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

表3 回归分析†Table 3 The results of regression analysis

† **表示差异极显著，P<0.01；*表示差异显著，P<0.05。

图6 各因素两两交互作用对总三萜提取率影响的响应面图Figure 6 Various factors on the impact of interaction on the yield of total triterpenoid

2.4 验证实验

根据上述分析研究，得到最佳提取条件：浸提温度57.10 ℃，乙醇体积分数70.00%，浸提时间46.06 min，料液比1∶13.61 (g/mL)，超声时间30 min，该条件下总三萜提取率为3.09%。

为了验证响应面优化结果的可靠性，以及可操作性，将提取条件修正为乙醇体积分数70%，浸提时间46 min，浸提温度57 ℃，料液比1∶14 (g/mL)，超声时间30 min。按上述条件进行3次平行验证实验，得泽泻总三萜平均提取率为2.98%，与理论预测值基本一致，相对偏差为3.62%。

3 结论

本试验最终确定泽泻总三萜最佳提取工艺为：乙醇体积分数70%、浸提时间46 min，浸提温度57 ℃、料液比1∶14 (g/mL)，超声时间30 min，在此条件下总三萜得率为2.98%。

本研究与传统的乙醇回流提取、超临界二氧化碳萃取相比，超声提取能显著提高总三萜提取率，经济有效，同时增加了温度浸提对提取率的影响，更加全面地阐述了试验因素对提取率的影响。不足之处是在超声提取时采取人工控温，可能存在误差，若测定时采用高效液相色谱法，结果可能更精确。

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