五味子助眠成分的分离鉴定

张梓毓ZHANG Zi-yu 徐德平 -

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物，《中华人民共和国药典》收录有2种五味子药材，分别为北五味子 (SchisandrachinensisBaill) 和华中五味子 (SchisandrasphenantheraRehd.et Wils) 的成熟干燥果实(南五味子)[1]。五味子中含有多种成分，具有镇静安神、收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效。近年来，中国对五味子的研究[2-3]显示木质素类物质为五味子中具有镇静安神的功效成分，并阐明其结构。以往研究的重点在于五味子中的木质素类、萜类等较为复杂的有机物上[4-6]，忽略了一些结构简单却同样具有较好助眠功效的物质。现有的相关研究对五味子中氨基酸的报道仅停留在分离和结构鉴定上，并没对其中氨基酸的功能性作用进行研究，本试验拟对五味子不同提取物的助眠作用进行研究，通过分析脑部组织的神经递质含量的变化得到除木质素类物质外的具有助眠作用的氨基酸，为五味子进一步开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

北五味子：安徽亳州药材市场；

DA标准品：美国Sigma公司；

无水乙醇、高氯酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

甲醇、磷酸二氢钾：色谱级，国药集团化学试剂有限公司；

硅胶板：GF254，山东烟台芝罘化工厂；

大孔吸附树脂：AB-8 型，天津南开大学化学工厂；

Octadecylsilyl(ODS)填料：北京绿百草科技发展有限公司；

Middle Chromatogram Isolated Gel(MCI GEL) 填料：三菱化学控股集团。

1.2 试验仪器

龙视安摄像头：LS-Q130W-1型，广东东莞市盛鼎电子科技有限公司；

磨粉机：CLF-205型，浙江省温州市创立药材器械厂；

萃取罐：RAT-100型，无锡申科仪器有限公司；

旋转蒸发器：R-1002型，上海申顺生物科技有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-4型，江苏省金坛市荣华仪器厂；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技术公司；

暗箱式紫外透射仪：ZF-90型，上海顾村电光仪器厂；

可见分光光度计：WFJ 2000型，优尼柯上海仪器有限公司；

核磁共振仪：Avance 500 MHz型，美国Bruker 公司；

高效液相色谱仪(紫外+荧光检测器)(反相)：1525型，美国沃特世公司。

1.3 试验动物

SPF级昆明小鼠：18～22 g，上海斯莱克实验动物有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 五味子提取物的制备 将10 kg北五味子粉碎后，按料液比1∶10 (g/mL)加入体积分数为80%的乙醇，于50 ℃搅拌提取3 h，过滤取上清液，重复2次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得五味子醇提物，于-18 ℃保存备用[7]。

1.4.2 五味子活性成分的粗分 将已得到的五味子醇提物用AB-8型大孔树脂柱(12 cm×150 cm)进行分离[8]，用体积分数为30%，50%，70%，95%的乙醇洗脱，分别得到30%乙醇洗脱物(1)、50%乙醇洗脱物(2)、70%乙醇洗脱物(3)和95%乙醇洗脱物(4)4个部分，浓缩并冷冻保存备用。大孔树脂粗分离后经试验确定有助眠活性部分用MCI柱(5 cm×100 cm)进一步分离，用去离子水和体积分数为30%，50%的乙醇洗脱，分别得到水洗脱物(5)、MCI柱30%乙醇洗脱物(6)和MCI柱50%乙醇洗脱物(7)3个部分，浓缩并冷冻保存备用。

1.4.3 五味子助眠作用 取小鼠80只，体重18～22 g，随机分成8组，每组10只，灌胃给药。灌胃剂量分别为：五味子大孔树脂30%乙醇洗脱物(A组)1 g/kg·BW；50%乙醇洗脱物(B组)1 g/kg·BW；70%乙醇洗脱物(C组)1 g/kg·BW；95%乙醇洗脱物(D组)1 g/kg·BW；五味子MCI柱水洗脱物(A1组)1 g/kg·BW；五味子MCI柱30%乙醇洗脱物(A2组)1 g/kg·BW；五味子MCI柱50%乙醇洗脱物(A3组)1 g/kg·BW；空白对照组(CK)给等量生理盐水。每天1次，连续给药1周。1周后用监控摄像观察并记录灌胃30 min 后各组小鼠的睡眠率、灌胃结束后12 h内各组小鼠的睡眠时间。

1.4.4 小鼠大脑皮层中多巴胺(DA)含量的测定

(1) 脑组织样品匀浆制备：取冷冻保存的大脑皮层组织称重，按1∶3 (g/mL)的比例加入0.01 mol/L 高氯酸溶液，置于冰上匀浆，4 ℃、13 000 r/min 离心10 min后取上清液，0.22 μm针头过滤器过滤后即可进样[9]。

(2) 色谱条件：色谱柱：Quattro 3 C18柱(150 mm×2.1 mm，3 μm) ；流动相：甲醇和0.1 mol/L磷酸二氢钾(体积比15∶85)； 流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL[10]。

(3) 数据处理和分析：记录每组HPLC图谱上的峰面积；并用SPSS 20. 0软件对试验所得数据进行统计，计量数据使用均值±标准差(mean±SD) 表示。组间差异比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1.5 五味子活性单体化合物的分离

大孔树脂柱和MCI柱分离后经试验确定具有活性成分的主要部分用ODS柱(4 cm×100 cm)分离，得到其中的单体。

2 分析与讨论

2.1 五味子大孔树脂不同洗脱部分助眠作用

五味子大孔树脂不同洗脱部分对小鼠睡眠率和睡眠时间的影响见表1，大孔树脂不同洗脱部分对小鼠大脑皮层中多巴胺含量的影响见图1。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图1 不同组别小鼠大脑中多巴胺(DA)的积分峰面积Figure 1 The peak areas of dopamine in different groups of mouse brains

由图1可知，五味子大孔树脂30%乙醇洗脱物的试验组小鼠脑中多巴胺(DA)含量最高，与空白组有显著性差异(P<0.05)，95%乙醇洗脱物的试验组小鼠脑中多巴胺(DA)的含量与空白组也具有显著性差异(P<0.05)。五味子大孔树脂30%乙醇洗脱物和95%乙醇洗脱物的试验组小鼠脑中多巴胺(DA)含量均高于大孔树脂50%乙醇洗脱物和70%乙醇洗脱物的。

由表1可知，五味子大孔树脂30%乙醇洗脱物的试验组小鼠睡眠时间和睡眠率均为最佳；95%乙醇洗脱物的试验组小鼠睡眠率和50%乙醇洗脱物的相同，但睡眠时间差异显著(P<0.05)；95%乙醇洗脱物的试验组小鼠睡眠率高于70%乙醇洗脱物的，但睡眠时间无显著性差异(P>0.05)。

综合表1和图1可知，五味子大孔树脂30%乙醇洗脱物和95%乙醇洗脱物均有较好的助眠作用，30%乙醇洗脱物的助眠效果要稍好于95%乙醇洗脱物的。

2.2 MCI不同分离部分的助眠作用

MCI不同分离部分对小鼠睡眠率和睡眠时间的影响见表2。

表1 不同洗脱部分对小鼠睡眠率和时间的影响†Table 1 Effect of different elution parts on the sleep rate and time of mice

† *表示与空白对照组比较差异显著，P<0.05。

表2 MCI不同分离部分对小鼠睡眠率和睡眠时间的影响†Table 2 Effect of different MCI resin separation section on the sleep rate and time of mice

† *表示与空白对照组比较差异显著，P<0.05。

由表2可得出，五味子MCI水洗脱物组小鼠的睡眠率最高为90%，同时睡眠时间最长，与其他2组和空白组均有显著性差异(P<0.05)。由此可知，五味子大孔树脂30%乙醇洗脱物中具有助眠作用的功效成分，且主要集中在MCI水洗脱物中。

2.3 单体化合物的分离与鉴定

从五味子MCI水洗脱物中分离得到Ⅰ和Ⅱ2个化合物，从五味子大孔树脂95%乙醇洗脱物中分离得到一个化合物Ⅲ。

化合物Ⅰ、Ⅱ均为黄色油状，易溶于水；结合其理化性质和13C-NMR解析，化合物Ⅰ为α-氨基-β-羟基异丁酸，化合物Ⅱ为β-乙氧基氨基丙酸。化合物Ⅲ为白色无定形粉末，易溶于甲醇、乙醇等溶剂；结合其理化性质和13C-NMR解析，参照文献[11]中的报道：化合物Ⅲ为戈米辛N。化合物Ⅰ、Ⅱ的核磁数据见表3，化合物Ⅲ的核磁数据见表4。化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的13C-NMR见图2，结构图见图3。

图2 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的13C-NMRFigure 2 13C-NMR spectrum of Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ

表3 化合物Ⅰ、Ⅱ的核磁数据Table 3 13C-NMR date of compoundⅠandⅡ

(a) 化合物Ⅰ (b) 化合物Ⅱ

(c) 化合物Ⅲ图3 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的结构Figure 3 Structure of compound Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ

表4 化合物Ⅲ的核磁数据Table 4 13C-NMR date of compound Ⅲ

3 结论

本试验研究结果表明，五味子中除了木质素类、萜类等较为复杂的有机物具有较好的活性外，氨基酸和有机酸等较为简单的化合物同样具有较好的活性，这为五味子功能性成分的开发进一步提供了依据，开拓了五味子功能性成分开发的视野。试验还发现，α-氨基-β-羟基异丁酸和β-乙氧基氨基丙酸具有助眠效果，但具体是哪一种氨基酸单独作用或者是哪几种氨基酸的协同作用还需要通过细胞试验与动物试验进一步验证。

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